diff --git a/.gitignore b/.gitignore index 98740e7..e801eac 100644 --- a/.gitignore +++ b/.gitignore @@ -5,8 +5,5 @@ /modules/fuscia /modules/flexiplex /modules/STAR -<<<<<<< HEAD -./.git/modules/STAR/objects/pack/pack-f67e728172242412d5bda22d0469194f2044564f.pack -./modules/STAR/.git/objects/pack/pack-f67e728172242412d5bda22d0469194f2044564f.pack -======= ->>>>>>> a4f53fdf61082f99d2cded4e28076871d04232ef +CLAUDE.md +.vscode/settings.json diff --git a/.gitmodules b/.gitmodules deleted file mode 100644 index 4aaf5c8..0000000 --- a/.gitmodules +++ /dev/null @@ -1,9 +0,0 @@ -[submodule "flexiplex"] - path = flexiplex - url = git@github.com:DavidsonGroup/flexiplex.git -[submodule "fuscia"] - path = fuscia - url = git@github.com:ding-lab/fuscia.git -[submodule "STAR"] - path = STAR - url = https://github.com/alexdobin/STAR diff --git a/README.md b/README.md index fcc655b..73bd217 100644 --- a/README.md +++ b/README.md @@ -1,6 +1,166 @@ -# [pears](https://davidsongroup.github.io/pears/) -Pipeline for g*e*ne-fusion seArching in Rna Single-cell sequences -- Aim: combine and increase finding power of fusions in single-cell RNA-seq data -- Adapted from: fuscia (Steven Foltz 2019) and flexiplex (Davidson et al. 2022) +# PEARS -- please run this only on VAST if you're running pears on the WEHI hpc +**P**ipeline for g**e**ne-fusion se**a**rching in **R**na **S**ingle-cell sequences + +PEARS is a Nextflow DSL2 pipeline that detects gene fusions at single-cell resolution from 10X scRNA-seq data. It combines three complementary fusion-calling approaches — [FUSCIA](https://github.com/ding-lab/fuscia), [Flexiplex](https://github.com/DavidsonGroup/flexiplex), and [Arriba](https://github.com/suhrig/arriba) — and assigns cell barcodes to each detected fusion event, producing per-cell fusion calls. + +## Pipeline overview + +1. **Reference preparation** — Downloads genome FASTA and GTF annotation (or uses pre-built references). +2. **Fusion target generation** — Builds search targets from a known fusions list using the reference annotation. +3. **Alignment** — Aligns reads with STARsolo (chimeric-aware) and produces a BAM and single-cell count matrix. +4. **Fusion detection** - Calls fusions using [FUSCIA](https://github.com/ding-lab/fuscia), [Flexiplex](https://github.com/DavidsonGroup/flexiplex), and [Arriba](https://github.com/suhrig/arriba) in parallel. +5. **Formatting** — Consolidates results into three CSV files of per-cell fusion calls (`fuscia_fusion_calls.csv`, `flexiplex_fusion_calls.csv`, `arriba_fusion_calls.csv`). + +## Requirements + +- [Nextflow](https://www.nextflow.io/) (>= 22.10) +- [Conda](https://docs.conda.io/) (environments are built automatically from `env/pears_env.yml`) + +## Usage + +Running locally: + +```bash +nextflow run DavidsonLab/pears \ + --fastq_r1 "/path/to/Reads_R1.fastq.gz" \ + --fastq_r2 "/path/to/Reads_R2.fastq.gz" \ + --known_fusions_list "known_fusions.csv" \ + --protocol "10x-3prime-v3" \ + --genome_version "GRCh38+GENCODE44" \ + -profile "local" +``` + +Running on SLURM cluster: + +```bash +nextflow run DavidsonLab/pears \ + --fastq_r1 "/path/to/Reads_R1.fastq.gz" \ + --fastq_r2 "/path/to/Reads_R2.fastq.gz" \ + --known_fusions_list "known_fusions.csv" \ + --protocol "10x-3prime-v3" \ + --genome_version "GRCh38+GENCODE44" \ + -profile "slurm" +``` + +## Arguments + +### Basic + +| Argument | Default | Description | +|---|---|---| +| `--fastq_r1` | — | Glob pattern or path to Read 1 FASTQ files (gzipped). | +| `--fastq_r2` | — | Glob pattern or path to Read 2 FASTQ files (gzipped). | +| `--known_fusions_list` | — | CSV file of known/candidate fusions to search for (see [Known fusions list format](#known-fusions-list-format)). | +| `--protocol` | — | 10x Chromium chemistry preset (see [Protocol presets](#protocol-presets)). Sets the barcode whitelist and UMI length automatically. | +| `--genome_version` | `GRCh38+GENCODE44` | Genome build to download. Available versions: `GRCh38+GENCODE40` through `GRCh38+GENCODE49`. | +| `--out_dir` | `pears_output` | Directory for all pipeline outputs. | +| `-profile` | — | Execution environment: `local` or `slurm`. | + +### Protocol presets + +`--protocol` sets the barcode whitelist and UMI length for the given 10x chemistry. These values can be individually overridden with `--barcode_include_list` and `--umi_len` (see [Read structure overrides](#read-structure-overrides)). + +| Preset | Chemistry | UMI length | Barcode whitelist | +|---|---|---|---| +| `10x-3prime-v2` | 3' Gene Expression v2 | 10 bp | 737K-august-2016 | +| `10x-3prime-v3` | 3' Gene Expression v3/v3.1 | 12 bp | 3M-february-2018 | +| `10x-3prime-v4` | 3' Gene Expression v4 | 12 bp | 3M-3pgex-may-2023 | +| `10x-5prime-v2` | 5' Gene Expression v1/v2 | 10 bp | 737K-august-2016 | +| `10x-5prime-v3` | 5' Gene Expression v3 | 12 bp | 3M-5pgex-jan-2023 | + +### Read structure overrides + +`--barcode_include_list` and `--umi_len` override the corresponding values set by `--protocol`. If `--protocol` is omitted entirely, **both** must be provided. + +| Argument | Default | Overrides | +|---|---|---| +| `--barcode_include_list` | *set by `--protocol`* | Barcode whitelist. Path to a custom whitelist file (can be gzipped). | +| `--umi_len` | *set by `--protocol`* | UMI length in bases. | + +### Pre-built reference overrides + +By default, the pipeline downloads the genome specified by `--genome_version` and builds the STAR index automatically. To skip this, provide **all three** arguments below — `--genome_version` is then ignored. + +| Argument | Default | Overrides | +|---|---|---| +| `--ref_fasta` | *downloaded* | Genome FASTA. Must be provided together with `--ref_gtf` and `--star_genome_index`. | +| `--ref_gtf` | *downloaded* | GTF annotation. Must be provided together with `--ref_fasta` and `--star_genome_index`. | +| `--star_genome_index` | *built from download* | STAR genome index directory. Must be provided together with `--ref_fasta` and `--ref_gtf`. | + +### Tool parameters + +| Argument | Default | Description | +|---|---|---| +| `--flexiplex_searchlen` | `20` | Length of fusion junction sequence to search for (2x actual overlap). | +| `--flexiplex_demultiplex_options` | *auto-generated* | Flexiplex demultiplexing options string. When not set, auto-generated as `-b "?{barcode_len}" -u "?{umi_len}" -e 1 -f 0` where barcode length is read from the whitelist file and UMI length comes from `--protocol` or `--umi_len`. Setting this explicitly overrides the auto-generated value. | +| `--fuscia_mapqual` | `30` | Minimum mapping quality for FUSCIA read extraction. | +| `--fuscia_up` | `1000` | Upstream search distance (bp) when no gene annotation is available. | +| `--fuscia_down` | `1000` | Downstream search distance (bp) when no gene annotation is available. | + +## Known fusions list format + +The `--known_fusions_list` input is a CSV with the following required columns: + +| Column | Description | +|---|---| +| `fusion genes` | Fusion gene pair separated by `--` (e.g. `BCAS4--BCAS3`). | +| `chrom1` | Chromosome of gene 1 (e.g. `chr20`). | +| `base1` | Breakpoint position of gene 1. | +| `strand1` | Strand of gene 1 (`+` or `-`). | +| `chrom2` | Chromosome of gene 2 (e.g. `chr17`). | +| `base2` | Breakpoint position of gene 2. | +| `strand2` | Strand of gene 2 (`+` or `-`). | + +Additional columns (e.g. `classification`) are ignored. This format is compatible with [JAFFA](https://github.com/Oshlack/JAFFA) output. Fusions involving mitochondrial genes (`MT-`) are automatically filtered out. + +Example: + +``` +fusion genes,chrom1,base1,strand1,chrom2,base2,strand2,classification +BCAS4--BCAS3,chr20,50795173,+,chr17,61368327,+,HighConfidence +RPS6KB1--VMP1,chr17,59914703,+,chr17,59839768,+,HighConfidence +SLC25A24--NBPF6,chr1,108161182,-,chr1,108470597,+,HighConfidence +``` + +## Output + +Results are written to `--out_dir` (default `pears_output/`): + +| File/Directory | Description | +|---|---| +| `fuscia_fusion_calls.csv` | Per-cell fusion calls from FUSCIA. | +| `flexiplex_fusion_calls.csv` | Per-cell fusion calls from Flexiplex. | +| `arriba_fusion_calls.csv` | Per-cell fusion calls from Arriba. | +| `STARsolo/` | BAM alignment, index, and single-cell count matrix. | +| `fuscia_out/` | Per-fusion FUSCIA discordant read files. | +| `flexiplex_out/` | Per-fusion Flexiplex barcode files. | +| `arriba_out/` | Arriba fusion table and per-fusion barcode files. | +| `fusion_targets.csv` | Generated fusion target coordinates and sequences. | +| `nextflow_report.html` | Nextflow execution report. | +| `nextflow_trace.txt` | Nextflow process trace log. | + +### Fusion calls CSV format + +The three fusion calls CSVs (`fuscia_fusion_calls.csv`, `flexiplex_fusion_calls.csv`, `arriba_fusion_calls.csv`) share the same format: + +| Column | Description | +|---|---| +| `cell_barcode` | 10x cell barcode (CB tag) identifying the single cell. The trailing `-1` suffix is stripped. | +| `molecular_barcode` | Unique Molecular Identifier (UMI / UB tag) distinguishing distinct RNA molecules from PCR duplicates within the same cell. | +| `fusion` | Detected gene fusion, formatted as `GENE1--GENE2` (names taken from the `--known_fusions_list` input). | + +Example: + +``` +cell_barcode,molecular_barcode,fusion +CCACAAAAGGTTCTTG,CAGGGATCAGTA,JPH1--NCOA2 +CAGGGCTCACTTGGGC,TGATAGGAATCG,JPH1--NCOA2 +GTGTGGCGTGGCCCAT,GGTAATCAGCAA,KIAA1429--RP11-586K2.1 +``` + +Each row represents one unique observation of a fusion transcript in a specific cell. Rows are deduplicated — each (cell_barcode, molecular_barcode, fusion) triple appears at most once. Multiple rows with different cell barcodes for the same fusion indicate independent cells harbouring that fusion. Multiple rows with the same cell barcode but different UMIs for the same fusion indicate multiple distinct fusion transcript molecules captured in that cell, providing stronger evidence. Fusions detected by more than one tool in the same cell are higher confidence and can be identified by cross-referencing the three CSVs. + +## Credits + +Adapted from [FUSCIA](https://github.com/ding-lab/fuscia) (Steven Foltz, 2019) and [Flexiplex](https://github.com/DavidsonGroup/flexiplex) (Davidson et al., 2022). diff --git a/assets/3M-3pgex-may-2023.txt.gz b/assets/3M-3pgex-may-2023.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..5571b83 Binary files /dev/null and b/assets/3M-3pgex-may-2023.txt.gz differ diff --git a/assets/3M-5pgex-jan-2023.txt.gz b/assets/3M-5pgex-jan-2023.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..49db705 Binary files /dev/null and b/assets/3M-5pgex-jan-2023.txt.gz differ diff --git a/modules/barcodes/737K-august-2016.txt b/assets/3M-february-2018.txt.gz similarity index 54% rename from modules/barcodes/737K-august-2016.txt rename to assets/3M-february-2018.txt.gz index eb62831..fd64bd3 100644 Binary files a/modules/barcodes/737K-august-2016.txt and b/assets/3M-february-2018.txt.gz differ diff --git a/assets/737K-august-2016.txt.gz b/assets/737K-august-2016.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..da0c2dc Binary files /dev/null and b/assets/737K-august-2016.txt.gz differ diff --git a/assets/visium-v1.txt.gz b/assets/visium-v1.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..2ceb9c1 Binary files /dev/null and b/assets/visium-v1.txt.gz differ diff --git a/assets/visium-v2.txt.gz b/assets/visium-v2.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..45459fc Binary files /dev/null and b/assets/visium-v2.txt.gz differ diff --git a/assets/visium-v3.txt.gz b/assets/visium-v3.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..e548fab Binary files /dev/null and b/assets/visium-v3.txt.gz differ diff --git a/assets/visium-v4.txt.gz b/assets/visium-v4.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..dbaf1e7 Binary files /dev/null and b/assets/visium-v4.txt.gz differ diff --git a/assets/visium-v5.txt.gz b/assets/visium-v5.txt.gz new file mode 100644 index 0000000..3cf83b2 Binary files /dev/null and b/assets/visium-v5.txt.gz differ diff --git a/bin/calculate_read_length.py b/bin/calculate_read_length.py new file mode 100755 index 0000000..d90afe2 --- /dev/null +++ b/bin/calculate_read_length.py @@ -0,0 +1,89 @@ +#!/usr/bin/env python3 +""" +Calculate the mode of R2 read lengths from FASTQ files. +Emits a warning if >10% of reads differ from the mode. + +Usage: + calculate_read_length.py [ ...] + +Output: + Prints the mode read length to stdout. + Warnings are printed to stderr. +""" + +import gzip +import sys +from collections import Counter +from pathlib import Path + + +def open_fastq(filepath): + """Open a FASTQ file, handling gzip if needed.""" + if str(filepath).endswith('.gz'): + return gzip.open(filepath, 'rt') + return open(filepath, 'r') + + +def get_read_lengths(fastq_files, max_reads=10000): + """Extract read lengths from the first max_reads of FASTQ files.""" + lengths = [] + reads_counted = 0 + + for fq in sorted(fastq_files): + if reads_counted >= max_reads: + break + with open_fastq(fq) as f: + line_num = 0 + for line in f: + line_num += 1 + # Sequence is on line 2 of each 4-line FASTQ record + if line_num % 4 == 2: + lengths.append(len(line.strip())) + reads_counted += 1 + if reads_counted >= max_reads: + break + return lengths + + +def main(): + if len(sys.argv) < 2: + print("Usage: calculate_read_length.py [ ...]", file=sys.stderr) + sys.exit(1) + + fastq_files = [Path(f) for f in sys.argv[1:]] + + # Validate files exist + for fq in fastq_files: + if not fq.exists(): + print(f"ERROR: File not found: {fq}", file=sys.stderr) + sys.exit(1) + + # Get read lengths + lengths = get_read_lengths(fastq_files, max_reads=10000) + + if not lengths: + print("ERROR: Could not read any sequences from FASTQ files", file=sys.stderr) + sys.exit(1) + + # Calculate mode + length_counts = Counter(lengths) + mode_length, mode_count = length_counts.most_common(1)[0] + total_reads = len(lengths) + + # Calculate percentage of reads matching mode + mode_percentage = (mode_count / total_reads) * 100 + non_mode_percentage = 100 - mode_percentage + + # Warn if >10% of reads differ from mode + if non_mode_percentage > 10: + print(f"WARNING: {non_mode_percentage:.1f}% of reads have length different from mode ({mode_length}bp)", file=sys.stderr) + print(f" Length distribution: {dict(length_counts.most_common(5))}", file=sys.stderr) + + print(f"R2 read length mode: {mode_length}bp ({mode_percentage:.1f}% of {total_reads} reads sampled)", file=sys.stderr) + + # Output the mode length to stdout + print(mode_length) + + +if __name__ == "__main__": + main() diff --git a/subworkflows/collate.R b/bin/collate.R old mode 100644 new mode 100755 similarity index 100% rename from subworkflows/collate.R rename to bin/collate.R diff --git a/bin/download_references.py b/bin/download_references.py new file mode 100755 index 0000000..926a110 --- /dev/null +++ b/bin/download_references.py @@ -0,0 +1,65 @@ +#!/usr/bin/env python + +import argparse +import urllib.request +import gzip + +GENOME_LINKS = { + "GRCh38": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_49/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz" +} + +ANNO_LINKS = { + "GENCODE40": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_40/gencode.v40.annotation.gtf.gz", + "GENCODE41": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_41/gencode.v41.annotation.gtf.gz", + "GENCODE42": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_42/gencode.v42.annotation.gtf.gz", + "GENCODE43": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_43/gencode.v43.annotation.gtf.gz", + "GENCODE44": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_44/gencode.v44.annotation.gtf.gz", + "GENCODE45": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_45/gencode.v45.annotation.gtf.gz", + "GENCODE46": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_46/gencode.v46.annotation.gtf.gz", + "GENCODE47": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_47/gencode.v47.annotation.gtf.gz", + "GENCODE48": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_48/gencode.v48.annotation.gtf.gz", + "GENCODE49": "https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_49/gencode.v49.annotation.gtf.gz" +} + + +def main(): + parser = argparse.ArgumentParser(description="Download reference genomes for PEARS") + parser.add_argument("--reference", required=True, help="Reference to download") + args = parser.parse_args() + + # Reference should be specified in the format "GENOME+ANNO", e.g. "GRCh38+GENCODE49" + if "+" not in args.reference: + print("Error: Reference should be specified in the format 'GENOME+ANNO', e.g. 'GRCh38+GENCODE49'") + return + + genome, anno = args.reference.split("+") + if genome not in GENOME_LINKS: + print(f"Error: Genome '{genome}' not found. Available genomes: {', '.join(GENOME_LINKS.keys())}") + return + + if anno not in ANNO_LINKS: + print(f"Error: Annotation '{anno}' not found. Available annotations: {', '.join(ANNO_LINKS.keys())}") + return + + genome_link = GENOME_LINKS[genome] + anno_link = ANNO_LINKS[anno] + + genome_name = genome_link.split("/")[-1] + anno_name = anno_link.split("/")[-1] + + print(f"Downloading genome from {genome_link}...") + urllib.request.urlretrieve(genome_link, genome_name) + with gzip.open(genome_name, "rb") as f_in: + with open(genome_name.replace(".gz", ""), "wb") as f_out: + f_out.write(f_in.read()) + print("Download complete.") + + print(f"Downloading annotation from {anno_link}...") + urllib.request.urlretrieve(anno_link, anno_name) + with gzip.open(anno_name, "rb") as f_in: + with open(anno_name.replace(".gz", ""), "wb") as f_out: + f_out.write(f_in.read()) + print("Download complete.") + +if __name__ == "__main__": + main() diff --git a/subworkflows/extract_arriba.py b/bin/extract_arriba.py similarity index 100% rename from subworkflows/extract_arriba.py rename to bin/extract_arriba.py diff --git a/bin/format_barcodes.py b/bin/format_barcodes.py new file mode 100755 index 0000000..5f5afd5 --- /dev/null +++ b/bin/format_barcodes.py @@ -0,0 +1,71 @@ +#!/usr/bin/env python3 +""" +Consolidate barcode formatting for Fuscia, Flexiplex, and Arriba outputs. +""" + +import argparse +import os +import pandas as pd + + +def format_fuscia(input_files): + """Format Fuscia output files.""" + df = pd.DataFrame(columns=['cell_barcode', 'molecular_barcode', 'fusion']) + + for file in input_files: + r = pd.read_table(file) + if not r.empty: + r['fusion'] = os.path.basename(file).split("_")[0] + r = r[r['cell_barcode'] != '-'] + df = pd.concat([df, r], axis=0, ignore_index=True) + + df['cell_barcode'] = df['cell_barcode'].str.replace('-1', "") + + df = df.iloc[:, :-3] + df = df.drop_duplicates() + return df + + +def format_flexiplex_arriba(input_files): + """Format Flexiplex or Arriba output files.""" + df = pd.DataFrame(columns=['cell_barcode', 'molecular_barcode', 'fusion']) + + for file in input_files: + if os.path.basename(file).startswith('barcodes'): + r = pd.read_table(file) + if not r.empty: + df_temp = pd.DataFrame().assign( + cell_barcode=r['CellBarcode'], + molecular_barcode=r['UMI'] + ) + df_temp['fusion'] = os.path.basename(file).split("_")[1] + df = pd.concat([df, df_temp], axis=0, ignore_index=True) + + df = df.drop_duplicates() + return df + + +def main(): + parser = argparse.ArgumentParser(description='Format barcode files from fusion detection tools') + parser.add_argument('--type', '-t', required=True, + choices=['fuscia', 'flexiplex', 'arriba'], + help='Type of input files to format') + parser.add_argument('--output', '-o', required=True, + help='Output CSV file path') + parser.add_argument('input_files', nargs='+', + help='Input files to process') + + args = parser.parse_args() + + if args.type == 'fuscia': + df = format_fuscia(args.input_files) + elif args.type in ['flexiplex', 'arriba']: + df = format_flexiplex_arriba(args.input_files) + else: + raise ValueError("Unsupported type. Use 'fuscia', 'flexiplex', or 'arriba'.") + + df.to_csv(args.output, index=False) + + +if __name__ == '__main__': + main() diff --git a/modules/fuscia/detect_discordant_reads.py b/bin/fuscia_detect_discordant_reads.py old mode 100644 new mode 100755 similarity index 96% rename from modules/fuscia/detect_discordant_reads.py rename to bin/fuscia_detect_discordant_reads.py index 8ea2b78..68bb25d --- a/modules/fuscia/detect_discordant_reads.py +++ b/bin/fuscia_detect_discordant_reads.py @@ -1,3 +1,4 @@ +#!/usr/bin/env python3 # Script to detect discordant reads from 10X single cell RNA-seq data # Usages: python detect_discordant_reads.py star-fusion_output_file scRNA-seq.bam output_dir output_prefix region_plusminus min_mapq # Author: Steven Foltz (June 2019) @@ -13,14 +14,14 @@ def extract_read_info(read, min_mapq): return(None) elif read.has_tag("CB") and read.has_tag("UB"): #and read.has_tag("BC"): return(return_read_info(read)) - else: + else: return(None) def return_read_info(read): # If a read passes quality filters and has CB, UB, and BC tags: # Return a dictionary of relevant read information, including # Mapping position of read and mate, all barcode information - return_dict = {} + return_dict = {} return_dict["this_chromosome"] = str(read.reference_name) return_dict["this_start_bp"] = int(read.reference_start) return_dict["this_end_bp"] = int(read.reference_end) @@ -50,8 +51,8 @@ def return_read_info(read): chromB = RightBreakpoint.split(":")[0][3:] min_posB = int(RightBreakpoint.split(":")[1]) - plusminus max_posB = int(RightBreakpoint.split(":")[1]) + plusminus - - # main business + + # main business rangeA_reads = {} rangeB_reads = {} @@ -62,12 +63,12 @@ def return_read_info(read): if read_info == None: next else: - CB = read_info["CB"] + CB = read_info["CB"] UB = read_info["UB"] if CB+":"+UB in rangeA_reads: rangeA_reads[CB+":"+UB].append(read_info) else: - rangeA_reads[CB+":"+UB] = [read_info] + rangeA_reads[CB+":"+UB] = [read_info] samfile.close() # iterate over rangeB @@ -104,4 +105,4 @@ def return_read_info(read): output_file.write("\t".join(["cell_barcode", "molecular_barcode", "chrom", "start", "end", "fusion"]) + "\n") # list of column headers for dis_read in sorted(unique_discordant_reads_list): output_file.write("\t".join(dis_read) + "\n") # write info for each discordant read -output_file.close() +output_file.close() diff --git a/modules/fuscia/discover_chimeric_transcripts.py b/bin/fuscia_discover_chimeric_transcripts.py old mode 100644 new mode 100755 similarity index 97% rename from modules/fuscia/discover_chimeric_transcripts.py rename to bin/fuscia_discover_chimeric_transcripts.py index 37e9084..337369f --- a/modules/fuscia/discover_chimeric_transcripts.py +++ b/bin/fuscia_discover_chimeric_transcripts.py @@ -1,3 +1,4 @@ +#!/usr/bin/env python3 # Script to discover transcripts with reads mapping to different chromosomes from 10X single cell RNA-seq data # Usages: python discover_discordant_reads.py scRNA-seq.bam chrA:pos-pos chrB:pos-pos output_dir output_prefix min_mapq # Author: Steven Foltz (June 2019) @@ -13,14 +14,14 @@ def extract_read_info(read, min_mapq): return(None) elif read.has_tag("CB") and read.has_tag("UB"): #and read.has_tag("BC"): return(return_read_info(read)) - else: + else: return(None) def return_read_info(read): # If a read passes quality filters and has CB, UB, and BC tags: # Return a dictionary of relevant read information, including # Mapping position of read and mate, all barcode information - return_dict = {} + return_dict = {} return_dict["this_chromosome"] = str(read.reference_name) return_dict["this_start_bp"] = int(read.reference_start) return_dict["this_end_bp"] = int(read.reference_end) @@ -54,7 +55,7 @@ def return_read_info(read): if read_info == None: next else: - CB = read_info["CB"] + CB = read_info["CB"] UB = read_info["UB"] if CB+":"+UB in chrA_reads: if read_info["this_chromosome"] in chrA_reads[CB+":"+UB]: @@ -62,7 +63,7 @@ def return_read_info(read): else: chrA_reads[CB+":"+UB][read_info["this_chromosome"]] = 1 else: - chrA_reads[CB+":"+UB] = {read_info["this_chromosome"]: 1} + chrA_reads[CB+":"+UB] = {read_info["this_chromosome"]: 1} samfile.close() print("through chrA first time") @@ -98,7 +99,7 @@ def return_read_info(read): print("found "+str(n_overlapping)+" overlapping barcodes") discordant_reads_list = [] - + # get reads from chimeric transcript # iterate over chrA (again) samfile = pysam.AlignmentFile(bam_filename, "rb") diff --git a/subworkflows/gen_masterdata.py b/bin/gen_fusion_targets.py similarity index 82% rename from subworkflows/gen_masterdata.py rename to bin/gen_fusion_targets.py index 2ade300..173d6c5 100755 --- a/subworkflows/gen_masterdata.py +++ b/bin/gen_fusion_targets.py @@ -1,3 +1,4 @@ +#!/usr/bin/env python3 """ Created on Mon Mar 20 20:11:22 2023 @@ -8,7 +9,7 @@ #input: gene_file(*/reference/gene/genes.gtf (refdata)), fusion_list (e.g. jjaffa output file) #if region is bigger/smaller than breakpoint site = region #output: {gene: [start, end]} -#issue: if name does not match (ENSG code might match) it is ignored. +#issue: if name does not match (ENSG code might match) it is ignored. import pandas as pd import pybedtools import os @@ -18,7 +19,7 @@ def get_gene_dict(shr_output): r = pd.read_csv(shr_output) f = r["fusion genes"].str.split('--', expand = True).to_numpy().flatten() - + gene_dict = {} for i in f: @@ -30,7 +31,7 @@ def get_gene_dict(shr_output): def get_gene_range(gene_gtf, gene_dict): df = pd.read_csv(gene_gtf, delimiter="\t", usecols=[0, 2, 3, 4, 8] , skiprows=(5), header=None, names=['chrom', 'feature', 'start', 'end', 'attributes']) - + df['attributes'] = df['attributes'].str.rsplit('gene_name "').str.get(1) df['attributes'] = df['attributes'].str.rsplit('";').str.get(0) @@ -85,7 +86,7 @@ def gene_range(shr_output, gene_dict, up, down): df['gene1'] = gene1 df['gene2'] = gene2 #df.set_index('fusion genes', inplace =True) - + return df def get_sequence(gene, fasta): @@ -114,7 +115,7 @@ def get_flexi_sequences(df, len_barcode, fasta): gene1seq = None gene2seq = None gene1_seq.append(str(gene1seq).upper()) - gene2_seq.append(str(gene2seq).upper()) + gene2_seq.append(str(gene2seq).upper()) df['sequence1'] = gene1_seq @@ -122,21 +123,26 @@ def get_flexi_sequences(df, len_barcode, fasta): return df -shr_output = sys.argv[1] -gene = sys.argv[2] -fasta = sys.argv[3] -flexi_searchlen = sys.argv[4] -out_dir = sys.argv[5] -up = sys.argv[6] -down = sys.argv[7] - -gene_dict = get_gene_dict(shr_output) -add_gene_range = get_gene_range(gene, gene_dict) -#with open(f'{out_dir}/generange.txt', 'w') as f: - #for key in add_gene_range.keys(): - #f.write("%s, %s\n"%(key, add_gene_range[key])) -fuscia_gene_range = gene_range(shr_output, add_gene_range, up, down) -flexi_gene_range = get_flexi_sequences(fuscia_gene_range, int(flexi_searchlen), fasta) -flexi_gene_range = flexi_gene_range.rename(columns={"fusion genes": "fusion_genes"}) -flexi_gene_range = flexi_gene_range.drop_duplicates() #remove duplicates in the fusion list -flexi_gene_range.to_csv(f'{out_dir}/masterdata.csv', index = False) +def main(): + shr_output = sys.argv[1] + gene = sys.argv[2] + fasta = sys.argv[3] + flexi_searchlen = sys.argv[4] + out_dir = sys.argv[5] + up = sys.argv[6] + down = sys.argv[7] + + gene_dict = get_gene_dict(shr_output) + add_gene_range = get_gene_range(gene, gene_dict) + #with open(f'{out_dir}/generange.txt', 'w') as f: + #for key in add_gene_range.keys(): + #f.write("%s, %s\n"%(key, add_gene_range[key])) + fuscia_gene_range = gene_range(shr_output, add_gene_range, up, down) + flexi_gene_range = get_flexi_sequences(fuscia_gene_range, int(flexi_searchlen), fasta) + flexi_gene_range = flexi_gene_range.rename(columns={"fusion genes": "fusion_genes"}) + flexi_gene_range = flexi_gene_range.drop_duplicates() #remove duplicates in the fusion list + flexi_gene_range.to_csv(f'{out_dir}/fusion_targets.csv', index = False) + + +if __name__ == "__main__": + main() diff --git a/env/pears_env.yml b/env/pears_env.yml index 0d25aef..22bd2db 100644 --- a/env/pears_env.yml +++ b/env/pears_env.yml @@ -1,11 +1,14 @@ name: pears channels: -- conda-forge -- bioconda + - conda-forge + - bioconda dependencies: - - python = 3.9 - - pysam - - pandas - - biopython - - pybedtools - - bedtools + - python=3.12 + - samtools=1.21 + - star=2.7.11b + - arriba=2.5.1 + - flexiplex=1.02.5 + - pysam=0.23.3 + - pandas=2.2.3 + - pybedtools=0.12.0 + - biopython=1.85 diff --git a/main.nf b/main.nf index 1dde70b..c770307 100644 --- a/main.nf +++ b/main.nf @@ -1,58 +1,169 @@ -//setting up scrips and software -include { GEN_MASTERDATA } from './subworkflows/gen_masterdata.nf' -include { RUN_STARsolo } from './subworkflows/run_STARsolo.nf' -include { runFuscia } from './subworkflows/fuscia.nf' -include { runFlexiplex } from './subworkflows/flexiplex.nf' -include { runArriba } from './subworkflows/arriba.nf' -include { formatFuscia } from './subworkflows/formatting.nf' -//include { formatFlexiplex } from './subworkflows/formatting.nf' -include { getBarcodes_Arriba } from './subworkflows/arriba.nf' -include {formatFlexiplex as formatFlexiplex1} from './subworkflows/formatting.nf' -include {formatFlexiplex as formatFlexiplex2} from './subworkflows/formatting.nf' - -//create channels -//ch_shr_output = params.shr_output ? file(params.shr_output) : file("${params.in_dir}/shr_output.csv") -//ch_reference = params.reference ? params.reference : "${params.in_dir}/reference" +nextflow.enable.dsl=2 -workflow { - GEN_MASTERDATA() - masterdata_ch = GEN_MASTERDATA.out - - mapped_ch = masterdata_ch \ - | splitCsv(header:true) \ - | map { row -> - tuple( - row.fusion_genes, - row.chrom1, - row.gene1, - row.base1, - row.sequence1, - row.chrom2, - row.gene2, - row.base2, - row.sequence2 - ) - } - - STARsolo_result = RUN_STARsolo() - - Fuscia_output_ch = runFuscia(mapped_ch, STARsolo_result[0], STARsolo_result[1]) -// Flexiplex_output_ch = runFlexiplex(mapped_ch, STARsolo_result[2]) - Flexiplex_output_ch = runFlexiplex(mapped_ch) - Arriba_output_ch = runArriba(STARsolo_result[0]) -// ArribaBC_output_ch = getBarcodes_Arriba(mapped_ch, Arriba_output_ch, STARsolo_result[2]) - ArribaBC_output_ch = getBarcodes_Arriba(mapped_ch, Arriba_output_ch) +include { validateParameters; paramsSummaryLog } from 'plugin/nf-schema' - // collapse each into a single emission - Fuscia_collected = Fuscia_output_ch | collect - Flexiplex_collected = Flexiplex_output_ch | collect - ArribaBC_collected = ArribaBC_output_ch | collect +include { downloadReferences } from './modules/download_references.nf' +include { genFusionTargets } from './modules/gen_fusion_targets.nf' +include { prepareIncludeList } from './modules/prepare_include_list.nf' +include { calculateReadLength } from './modules/calculate_read_length.nf' +include { buildSTARIndex; runSTARSolo } from './modules/star_solo.nf' +include { runFuscia } from './modules/fuscia.nf' +include { runFlexiplex } from './modules/flexiplex.nf' +include { runArriba } from './modules/arriba.nf' +include { formatFuscia; formatFlexiplex; formatArriba } from './modules/formatting.nf' +include { getBarcodesArriba } from './modules/arriba.nf' - // formatting - formatFuscia(Fuscia_collected, "master_fuscia.csv") - formatFlexiplex1(Flexiplex_collected, "flexiplex_out", "master_flexiplex.csv") - formatFlexiplex2(ArribaBC_collected, "arriba_out", "master_arriba.csv") +// Calculate barcode length from first line of barcode file (handles gzipped files) +def getBarcodeLength(barcode_path) { + def f = file(barcode_path) + def isGz = barcode_path.toString().endsWith('.gz') + def first_line = null + if (isGz) { + f.withInputStream { stream -> + new java.util.zip.GZIPInputStream(stream).withReader { reader -> + first_line = reader.readLine() + } + } + } else { + f.withReader { reader -> + first_line = reader.readLine() + } + } + if (!first_line) { + error "No valid barcode line found in file: ${barcode_path}" + } + return first_line.length() } +workflow { + // Validate parameters against schema + validateParameters() + log.info paramsSummaryLog(workflow) + + // 10x Chromium protocol definitions + // Maps protocol name to [barcode_file, umi_length] + def protocol_config = [ + // 3' Gene Expression chemistries + '10x-3prime-v2': ['737K-august-2016.txt.gz', 10], + '10x-3prime-v3': ['3M-february-2018.txt.gz', 12], + '10x-3prime-v4': ['3M-3pgex-may-2023.txt.gz', 12], + // 5' Gene Expression chemistries + '10x-5prime-v2': ['737K-august-2016.txt.gz', 10], + '10x-5prime-v3': ['3M-5pgex-jan-2023.txt.gz', 12] + ] + + def umi_length = null + def barcode_file = null + // Resolve protocol to barcode file and UMI length + if (params.protocol) { + def config = protocol_config[params.protocol] + barcode_file = params.barcode_include_list ?: "${projectDir}/assets/${config[0]}" + umi_length = params.umi_len ?: config[1] + log.info "Protocol ${params.protocol}: barcode_file=${barcode_file}, umi_len=${umi_length}" + } else if (params.barcode_include_list && params.umi_len) { + // Manual configuration + barcode_file = params.barcode_include_list + umi_length = params.umi_len + } else { + error "Either --protocol or both --barcode_include_list and --umi_len must be specified" + } + + // Build default flexiplex demultiplex options if not provided + def barcode_length = getBarcodeLength(barcode_file) + def barcode_pattern = "?" * barcode_length.toInteger() + def umi_pattern = "?" * umi_length.toInteger() + def default_flexiplex_opts = "-b \"${barcode_pattern}\" -u \"${umi_pattern}\" -e 1 -f 0" + flexiplex_demultiplex_options = params.flexiplex_demultiplex_options ?: default_flexiplex_opts + log.info "Flexiplex demultiplex options: ${flexiplex_demultiplex_options} (barcode_len=${barcode_length}, umi_len=${umi_length})" + + // Use pre-built references if all three are provided, otherwise download + if (params.ref_fasta && params.ref_gtf && params.star_genome_index) { + log.info "Using pre-built references: skipping download and index building" + ref_fasta = channel.value(file(params.ref_fasta)) + ref_gtf = channel.value(file(params.ref_gtf)) + star_index = channel.value(file(params.star_genome_index)) + } else { + // Download reference genome and annotation + references = downloadReferences(params.genome_version) + ref_fasta = references.fasta + ref_gtf = references.gtf + star_index = null // Will be built below + } + + // Prepare barcode include list (decompress if gzipped) + include_list = prepareIncludeList(file(barcode_file)) + + fusion_targets = genFusionTargets( + file(params.known_fusions_list), + ref_gtf, + ref_fasta, + params.flexiplex_searchlen, + params.fuscia_up, + params.fuscia_down + ) + fusion_target_rows = fusion_targets \ + | splitCsv(header:true) \ + | map { row -> + tuple( + row.fusion_genes, + row.chrom1, + row.gene1, + row.base1, + row.sequence1, + row.chrom2, + row.gene2, + row.base2, + row.sequence2 + ) + } + + // Build STAR index if not already provided via pre-built references + if (!params.star_genome_index) { + // Calculate R2 read length for STAR index generation + r2_files = channel.fromPath(params.fastq_r2).collect() + read_length = calculateReadLength(r2_files) + + star_index = buildSTARIndex( + ref_fasta, + ref_gtf, + read_length + ) + } + + star_solo_result = runSTARSolo( + channel.fromPath(params.fastq_r1).collect(), + channel.fromPath(params.fastq_r2).collect(), + star_index, + include_list, + umi_length + ) + + fuscia_result = runFuscia(fusion_target_rows, star_solo_result.bam, star_solo_result.bam_index, params.fuscia_mapqual) + flexiplex_result = runFlexiplex( + fusion_target_rows, + include_list, + channel.fromPath(params.fastq_r1).collect(), + channel.fromPath(params.fastq_r2).collect(), + flexiplex_demultiplex_options + ) + arriba_output = runArriba(star_solo_result.bam, ref_fasta, ref_gtf) + arriba_bc_output = getBarcodesArriba( + fusion_target_rows, + arriba_output, + include_list, + channel.fromPath(params.fastq_r1).collect(), + flexiplex_demultiplex_options + ) + + // collapse each into a single emission + fuscia_collected = fuscia_result | collect + flexiplex_collected = flexiplex_result | collect + arriba_bc_collected = arriba_bc_output | collect + + // formatting + formatFuscia(fuscia_collected, "fuscia_fusion_calls.csv") + formatFlexiplex(flexiplex_collected, "flexiplex_fusion_calls.csv") + formatArriba(arriba_bc_collected, "arriba_fusion_calls.csv") +} diff --git a/modules/.flexiplex.nf.swp b/modules/.flexiplex.nf.swp deleted file mode 100644 index 4fdf2e9..0000000 Binary files a/modules/.flexiplex.nf.swp and /dev/null differ diff --git a/modules/arriba b/modules/arriba deleted file mode 160000 index 786f647..0000000 --- a/modules/arriba +++ /dev/null @@ -1 +0,0 @@ -Subproject commit 786f647a73b8ffb8bbe38b6607460c27e17e8846 diff --git a/modules/arriba.nf b/modules/arriba.nf new file mode 100755 index 0000000..c171917 --- /dev/null +++ b/modules/arriba.nf @@ -0,0 +1,59 @@ +process runArriba { + label 'process_medium' + publishDir "${params.out_dir}/arriba_out", mode: 'copy' + + input: + path(bam_file) + path(ref_fasta) + path(ref_gene) + + output: + path("fusions.tsv") + + script: + """ + arriba \ + -x ${bam_file} \ + -o fusions.tsv \ + -O fusions.discarded.tsv \ + -a ${ref_fasta} \ + -g ${ref_gene} \ + -f blacklist + """ +} + +process getBarcodesArriba { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}/arriba_out", mode: 'copy' + + input: + tuple val(fusion_genes), val(chrom1), val(gene1), val(base1), val(sequence1), val(chrom2), val(gene2), val(base2), val(sequence2) + path(fusion_table) + path(include_list) + path(fastq_r1) + val(flexiplex_demultiplex_options) + + output: + path("barcodes_${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}_reads_barcodes.txt") + + script: + """ + set +e + + fus=`echo ${fusion_genes} | sed 's/--/\t/g'` ; + pos=`echo -e "${chrom1}:${base1}\t${chrom2}:${base2}"` + fusion_name=`echo ${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}` + + grep -e "\$fus" -e "\$pos" ${fusion_table} |\ + cut -f30 |\ + sed 's/,/ \\n/g' |\ + sed 's/^/^@/g' |\ + grep -f - <(gunzip -c ${fastq_r1}) -A3 --no-group-separator |\ + sed "/^[@+]/! s/^/START/g" > "\$fusion_name".fastq ; + + flexiplex -x START \ + ${flexiplex_demultiplex_options} \ + -k ${include_list} -n barcodes_"\$fusion_name" \ + "\$fusion_name".fastq + """ +} diff --git a/modules/barcodes/visium-v1.txt b/modules/barcodes/visium-v1.txt deleted file mode 100644 index 89b7224..0000000 --- a/modules/barcodes/visium-v1.txt +++ /dev/null @@ -1,4992 +0,0 @@ -AAACAACGAATAGTTC -AAACAAGTATCTCCCA -AAACAATCTACTAGCA -AAACACCAATAACTGC -AAACAGAGCGACTCCT -AAACAGCTTTCAGAAG -AAACAGGGTCTATATT -AAACAGTGTTCCTGGG -AAACATGGTGAGAGGA -AAACATTTCCCGGATT -AAACCACTACACAGAT -AAACCCGAACGAAATC -AAACCGGAAATGTTAA -AAACCGGGTAGGTACC -AAACCGTTCGTCCAGG -AAACCTAAGCAGCCGG -AAACCTCATGAAGTTG -AAACGAAGAACATACC -AAACGAAGATGGAGTA -AAACGACAGTCTTGCC -AAACGAGACGGTTGAT -AAACGCCCGAGATCGG -AAACGCTGGGCACGAC -AAACGGGCGTACGGGT -AAACGGGTTGGTATCC -AAACGGTTGCGAACTG -AAACGTGTTCGCCCTA -AAACTAACGTGGCGAC -AAACTCGGTTCGCAAT -AAACTCGTGATATAAG -AAACTGCTGGCTCCAA -AAACTTAATTGCACGC -AAACTTGCAAACGTAT -AAAGAATGACCTTAGA -AAAGAATGTGGACTAA -AAAGACATGAAGTTTA -AAAGACCCAAGTCGCG -AAAGACTGGGCGCTTT -AAAGCTTGCCTACATA -AAAGGCCCTATAATAC -AAAGGCTACGGACCAT -AAAGGCTCTCGCGCCG -AAAGGGATGTAGCAAG -AAAGGGCAGCTTGAAT -AAAGGTAAGCTGTACC -AAAGGTCAACGACATG -AAAGTAGCATTGCTCA -AAAGTCACTGATGTAA -AAAGTCGACCCTCAGT -AAAGTGCCATCAATTA -AAAGTGTGATTTATCT -AAAGTTGACTCCCGTA -AAATAACCATACGGGA -AAATAAGGTAGTGCCC -AAATACCTATAAGCAT -AAATAGCTTAGACTTT -AAATAGGGTGCTATTG -AAATCACTCCTAAACG -AAATCCGATACACGCC -AAATCGCGGAAGGAGT -AAATCGTGTACCACAA -AAATCTAGCCCTGCTA -AAATCTGCCCGCGTCC -AAATGACTGATCAAAC -AAATGATTCGATCAGC -AAATGCTCGTTACGTT -AAATGGCATGTCTTGT -AAATGGCCCGTGCCCT -AAATGGTCAATGTGCC -AAATGTATCTTATCCC -AAATGTGGGTGCTCCT -AAATTAACGGGTAGCT -AAATTAATAAGCGCGA -AAATTACACGACTCTG -AAATTACCTATCGATG -AAATTCCAGGTCCAAA -AAATTGATAGTCCTTT -AAATTGCGGCGGTTCT -AAATTGGTGAGAAGCA -AAATTTACCGAAATCC -AAATTTGCGGGTGTGG -AACAACTGGTAGTTGC -AACAATACATTGTCGA -AACAATTACTCTACGC -AACACACGCTCGCCGC -AACACGACTGTACTGA -AACACGAGACGCGGCC -AACACGCGGCCGCGAA -AACAGCTGTGTGGCAA -AACAGGAAATCGAATA -AACAGGATGGGCCGCG -AACAGGTAGTATGGAT -AACATAGCGTGTATCG -AACATATCAACTGGTG -AACATCGATACGTCTA -AACATTGAAGTTGATC -AACATTGGTCAGCCGT -AACATTGTGACTCGAG -AACCAAGACTTCTCTG -AACCAGTATCACTCTT -AACCATAGGGTTGAAC -AACCATGGGATCGCTA -AACCCAGAGACGGAGA -AACCCATCCCATGATC -AACCCGACAACCCGTG -AACCCGAGCAGAATCG -AACCCGATAGGGCTTC -AACCCGCTGTATTCCA -AACCCTACTGTCAATA -AACCCTGGTGGAACCA -AACCGAGCTTGGTCAT -AACCGCTAAGGGATGC -AACCGTTGTGTTTGCT -AACCTAAAGCCGTCCG -AACCTCGCTTTAGCCC -AACCTGTCACGGAATT -AACCTTTAAATACGGT -AACCTTTACGACGTCT -AACGAAAGTCGTCCCA -AACGACCTCCTAGCCG -AACGATAATGCCGTAG -AACGATAGAAGGGCCG -AACGATATGTCAACTG -AACGCATGATCTGGGT -AACGCGAACGGCAACA -AACGCGACCTTGGGCG -AACGCGGTCTCCAGCC -AACGCTGTTGCTGAAA -AACGGACGTACGTATA -AACGGCCATCTCCGGT -AACGTACTGTGGGTAC 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-TGGCGAATCATGTACA -TGGCGAATCTACTCTT -TGGCGAATGTCTTCGA -TGGCGACACGGAGCAC -TGGCGACAGGCGAGAA -TGGCGAGCCTAATAGT -TGGCGAGGAAGTTCGT -TGGCGATAACGATTCA -TGGCGATACAATGAGT -TGGCGATAGTACCGTG -TGGCGATATCCGGTGG -TGGCGGCCGCAACGTC -TGGCTCATCGTCTTGG -TGGCTCCAGTCCAGAC -TGGCTCCATAGACGTT -TGGCTCCGCACTTCGG -TGGCTCCGCCAGCAGT -TGGCTCGACTACAACT -TGGCTCTAAGCGACGG -TGGCTCTTGATAACTC -TGGCTGAAGCTGCATC -TGGCTGAATCGACAGA -TGGCTGAATGCCAGGT -TGGCTGAATTAAGTCG -TGGCTGAGCATGTATT -TGGCTGCAACCATACT -TGGCTGCAGCGGAGTA -TGGCTGCATTCCGAAT -TGGCTGGAATCTACCA -TGGCTGGACGGAGTAT -TGGCTGGCAATACGAT -TGGCTGGCCTTAGGCC -TGGCTGGCGGACCAGA -TGGCTGGTATAACTCC -TGGCTGGTGCGACGCT -TGGCTGTTACGCCAAT -TGGCTGTTATCAGGAA -TGGCTGTTGCGTTATC -TGGCTGTTGGACTCGG -TGGTAAGCTTAGATGC -TGGTAATTAGTTCAAC -TGGTACAATCCATACG -TGGTACAATTATCGCA -TGGTACATTGAGACGC -TGGTACCATAGAGCTC -TGGTACCATCCGAGCC -TGGTACCGTATGACAA -TGGTACCGTTAAGCCG -TGGTACCGTTCCTTGT -TGGTACCGTTGACAAC -TGGTACGGCGAGATTA -TGGTACGGCGGTCCGA -TGGTACGGTGCCACAT -TGGTACGGTGTCCGGC -TGGTACGTCATGTCCT -TGGTACGTCTTCGCTA -TGGTACGTTCAGCATT -TGGTACTCACTGATCT -TGGTACTCCTCATGTT -TGGTACTCGATCAGAA -TGGTACTCGCCTTGCC -TGGTACTCGTTGACTC -TGGTACTCTTCGCTCG -TGGTACTGCACTGTCG -TGGTACTTATCGAACC -TGGTACTTATTGCCGT -TGGTACTTGTACGTGA -TGGTACTTGTCTACAT -TGGTAGAAGCTATGCA -TGGTAGCAGGTGTTCT -TGGTAGGCTGAATGTA -TGGTAGTTATAGTGTT -TGGTATACTCCAGAGC -TGGTATAGATCTAGCC -TGGTATCTTAATTACC -TGGTATCTTCCTACAA -TGGTATGTATGGAGTC -TGGTATTACAACCGTG -TGGTATTACGGACTTA -TGGTATTAGTATTGCT -TGGTATTCTGTATTCT -TGGTCAATGGACGTTG -TGGTCATGCTTCGCCA -TGGTCGAGGATCCTCG -TGGTCGAGGCCTGAGT -TGGTCGCCAAGTTAGG -TGGTCGCTGCCTAGAT -TGGTCTCATTCGGAGG -TGGTCTGATAGAGTAT -TGGTCTGCAGCCAATT -TGGTCTGGATACGTTA -TGGTCTTCTGATTAGA -TGGTGAAGCGGCACAA -TGGTGATGTCGCCTTC -TGGTGCAGGCAGGTGA -TGGTGCAGGTCAAGAC -TGGTGCAGTTCTGAAT -TGGTGCATCACTGTAA -TGGTGCATTGAGCTTG -TGGTGCCGAACAGTCA -TGGTGCCGTAACTCGG -TGGTGCCTCAGGACTA -TGGTGCCTCGATGACG -TGGTGCGACTAAGTTA -TGGTGCGACTATACCG -TGGTGCGAGCAAGCAC -TGGTGCGAGGCGTAGC -TGGTGCGATAAGTTGT -TGGTGCGATATCCAAC -TGGTGCGATGTCACCA -TGGTGCGGTTGTCTCA -TGGTGCTCACTATCTA -TGGTGCTCGTGCGTTC -TGGTGCTCTACTTGAA -TGGTGCTTGCGTATCT -TGGTTAACAGATAACA -TGGTTAACTGCCATGG -TGGTTACGAGATGCAA -TGGTTACGCCTTGGTC -TGGTTATTCAGATAGT -TGGTTATTCCAATGCA -TGGTTGAAGTTACGTG -TGGTTGAATGGATAAG -TGGTTGATCAATTAAG -TGGTTGATCAGGCACT -TGGTTGGAACAGCTTA -TGGTTGGACATATCTT -TGGTTGGAGCCGCAAT -TGGTTGGATATGAGAA -TGGTTGGATTAATGAT -TGGTTGGATTCCTTCG -TGGTTGGCACGGTATT -TGGTTGGCCTAGTGGA -TGGTTGGCGGAGTACG -TGGTTGGCTTGGTCAC -TGGTTGGTAATAGCGA -TGGTTGGTCTATTCCT -TGGTTGGTTCGCGGCC -TGGTTGGTTCGTTAGG -TGGTTGTAACATTGGC -TGGTTGTATGCAACGA -TGGTTGTCCTCAGAAG -TGGTTGTCGCGAGTAA -TGTAACATCAACTTGT -TGTAACGTATTGAGGC -TGTAAGCGCATGCCGT -TGTAAGCGCTCACTCA -TGTAAGCTGTACCAGA -TGTAAGGAATGTCAGT -TGTAAGGCTTGCCAAC -TGTAAGTGCTTGAGTT -TGTAATACTGCGTGCC -TGTAATCGCATAGGAT -TGTAATCGTCCTATTA -TGTAATCTAACATTCG -TGTAATGAGTGCAGTG -TGTAATGATACACTAC -TGTAATGTATTCGAAT -TGTAATGTCATTCCGA -TGTAATTAACGTCAAC -TGTAATTATGATTGCG -TGTAATTGAAGCGTGA -TGTAATTGTTCCAGCT -TGTACACGCCATACCA -TGTACCAACGTGCGAT -TGTACCAAGTTGGTAA -TGTACCACATGGCGTG -TGTACCGCATCCGGCG -TGTACCGGTGCCGTTG -TGTACCGTCGGCCACT -TGTACCGTGAATTGCG -TGTACCTACCATAGCC -TGTACCTACGGCGTTA -TGTACCTGGACCGGAA -TGTACCTTCAAGCTGG -TGTACTCGGATACTCA -TGTACTCGGTTCAACT -TGTAGACCGCACGTAA -TGTAGCTCGGTACAGA -TGTAGGACGACTTCGC -TGTAGGACGGATCCAT -TGTAGGAGCGGCACGC -TGTAGGAGGCATACTA -TGTAGGAGGCTAGCAG -TGTAGGAGGCTCTGCC -TGTAGGAGGTGCCTTC -TGTAGGAGTGTACCGA -TGTAGGATAATCGCTG -TGTAGGCAAGTTAGAT -TGTAGGCACTGACAAT -TGTAGGCAGCAACAGG -TGTAGGTCGGCATACG -TGTAGGTGATTGTTAG -TGTAGGTGGACCTCTA -TGTAGGTGTCACTGGA -TGTAGGTGTCATGTTC -TGTAGGTTATACGGCG -TGTAGGTTCTTGAACG -TGTAGTAACTTAATCG -TGTAGTAATTCCTCGG -TGTAGTCCAATAGATT -TGTAGTCTATCACCGC -TGTAGTGCAGCGCATG -TGTAGTGGCTCCTAAT -TGTAGTGGTTGTTCTG -TGTAGTTCGCCAGGTT -TGTATCACCATCGACT -TGTATCCGATAATTAC -TGTATCCGCAGTTATC -TGTATCCGGATAACTG -TGTATCCGTCCGTTCG -TGTATCGCACAATATC -TGTATCGTACTCGGTG -TGTATCGTGGTAGCAT -TGTATCGTTCACCACG -TGTATCTATTCCGCAG -TGTATCTGCAGAGTGG -TGTATCTGCCACATCT -TGTATCTGCGCTCAAG -TGTATGAAGCCGTGTT -TGTATGAAGCGTATTC -TGTATGAATACATACG -TGTATGACAACCTATC -TGTATGACCTTACGTA -TGTATGACTCTGCGCC -TGTATGATCGTTAACC -TGTATGATTAACTTCA -TGTATGCATTGCGGTG -TGTATGCCGCCTCCTT -TGTATGCCTCCAATAA -TGTATGCTATGGTGAA -TGTATGCTTCACGATA -TGTATGGACACTATCA -TGTATGGATAGGCTCG -TGTATGGATGGTAACT -TGTATGGTAATACTAG -TGTATGGTAGGCGTGC -TGTATGGTCCGTTGTA -TGTATGTCCGGCTCTG -TGTATGTCTAGTCGAA -TGTATTAGATCGTCCA -TGTATTGACTGGAACA -TGTATTGTATACCGGC -TGTCAACACTCAGCGG -TGTCAACACTTCAGTT -TGTCAACCAATACCTC -TGTCAACCTACGCATA -TGTCAACCTGCTAACT -TGTCAAGAACTGATTC -TGTCAAGACGAACTCC -TGTCAAGAGCAGGACC -TGTCAAGCGTCTATTG -TGTCAAGTAACCTGAG -TGTCAAGTAGTTCTCA -TGTCAAGTCCTTAGGC -TGTCAAGTCTATTAAG -TGTCAAGTTGAGATTG -TGTCAAGTTGCGTAGA -TGTCAATAAGACGTCA -TGTCAATACATACTGG -TGTCAATATCATCCTA -TGTCAATATGTAGCCG -TGTCAATCGCATGGCG -TGTCAATGCGAAGGAG -TGTCAATGCTGAGTGA -TGTCAATGGCCAGGTA -TGTCAATTACCAAGCG -TGTCACAATGCACGTA -TGTCACAGACAAGCCA -TGTCACAGCCACGATC -TGTCACAGTAGCGACG -TGTCACAGTTCCGTAA -TGTCACCAAGTGCATC -TGTCACCACGGCGATG -TGTCACCATAACAGTA -TGTCACGTGAAGGTCT -TGTCACGTGCAGCCAA -TGTCACGTTGTCAATA -TGTCACTACAGACGCC -TGTCACTAGCAGTTGA -TGTCACTCATAAGGAA -TGTCAGAATCCTTGCG -TGTCAGAATGGCTCTG -TGTCAGACATGCGAAG -TGTCAGACGTGCTGCC -TGTCAGATAAGAACTA -TGTCAGATAATCTAGG -TGTCAGATGAGTGGCG -TGTCAGATTACGCAGT -TGTCAGCAACTCTGGC -TGTCAGCATATCGCAT -TGTCAGCGCTCGACAT -TGTCAGCGGCAACTCC -TGTCAGCGTAACGTTC -TGTCAGGTCGGCCAGC -TGTCAGGTTAATGCAA -TGTCAGTCACAATCGG -TGTCAGTCCAACTCCT -TGTCAGTGACTGCAGA -TGTCAGTGATACGGTT -TGTCAGTGATCGTGCG -TGTCAGTGGAGCCGTA -TGTCAGTGTACCTTAG -TGTCATAGCACTATGT -TGTCATCCACAGCAGT -TGTCCACGGATGGTGA -TGTCCATGTATTCGCC -TGTCCGCCGATCTGTA -TGTCCTAATAACGGAA -TGTCCTACAGGAATCA -TGTCCTACCATCTTCG -TGTCCTAGACATCATT -TGTCCTAGCAATTGTA -TGTCCTAGGCACTCGC -TGTCCTAGTGGCGTCC -TGTCCTCATACCGACT -TGTCCTCATCACCTCC -TGTCCTCATGAAGCTG -TGTCCTCATGATTACA -TGTCCTGGCCTATGTT -TGTCCTGGCTCGCTTC -TGTCCTGGTCGACACC -TGTCCTGTCGGTGGCG -TGTCCTTAAGCGAGAA -TGTCCTTAATGCGAAC -TGTCCTTCCTCGTACA -TGTCCTTGACTAAGGC -TGTCCTTGGTACCATC -TGTCCTTGTTGGTATT -TGTCGAAGGTCGGCTT -TGTCGACGCACCGTGG -TGTCGAGGTCACAGGC -TGTCGAGGTGCGCACC -TGTCGAGTTAGCTTAT -TGTCGATCAGGTTACT -TGTCGATCGAACTCAC -TGTCGATCGATCGATT -TGTCGATCGCTACGCT -TGTCGATCTGATGTTG -TGTCGCAACCAGACAA -TGTCGCAAGACTGTTG -TGTCGCACAAGACACC -TGTCGCACCGTTGTGG -TGTCGCGGCTACGCAC -TGTCGCGTCTGATAGA -TGTCGCTATCTGGCGA -TGTCGCTCGGCCAGTA -TGTCGTCTTCGACATA -TGTCGTGCTACAACGT -TGTCGTTAGCTGTATC -TGTCTAAGGTATCATG -TGTCTAATCTGTAGCA -TGTCTAATGCTTCGGA -TGTCTAATTAGGTCTA -TGTCTATGATGTTGAG -TGTCTGCCATACCGCC -TGTCTGCCATTGAACA -TGTCTGCCTCGTTAAG -TGTCTGCGACCTATTC -TGTCTGCGAGTTCATT -TGTCTGCGTGCCTGGC -TGTCTGGAATCATAGG -TGTCTGGACATATGAA -TGTCTGGATTACTATT -TGTCTGTACTCACTAA -TGTCTGTCCATTGACG -TGTCTTACAAGCCTTC -TGTCTTATACTAGGTC -TGTCTTCAGAAGTGCC -TGTCTTCAGCGTCAGC -TGTCTTCCATGTCTAA -TGTCTTCCGGTGCTCC -TGTCTTCCTGACCGAG -TGTCTTGCATAGTAAC -TGTCTTGGATCGGACT -TGTCTTGGCAGTTAGA -TGTCTTGGCGTCTGAC -TGTCTTGGCTACCTGG -TGTTAACGAGACATCG -TGTTAACGAGCGTCCA -TGTTAACGCATGGATA -TGTTAATCAGCGAGGA -TGTTAATCCGATCGTG -TGTTAATGATTCACTA -TGTTACAACGCTAATT -TGTTACAACGGTGCCA -TGTTACAACTAAGGTT -TGTTACAATCAATCTA -TGTTACCGAGCAATGA -TGTTACGCAGAAGGCC -TGTTAGCGTCGAGGAA -TGTTAGGATTGTCTTG -TGTTATCCAGTACCGA -TGTTATCCTACCGTGC -TGTTATGCCGGTCTGC -TGTTATGTACGCATAC -TGTTCAACGACTGCAT -TGTTCACCAAGAACGA -TGTTCACCGAGCGATG -TGTTCACCTATGAGAA -TGTTCACTCAGTTCGC -TGTTCACTCCTTGACT -TGTTCACTTAAGTAAG -TGTTCACTTCACATAA -TGTTCACTTCTGCTGG -TGTTCAGAATCCTAAT -TGTTCAGCGATTACGG -TGTTCATAGCAATAGA -TGTTCATATCTATGAC -TGTTCATATGACGCAA -TGTTCATATTCGGCTC -TGTTCATTGTACTATT -TGTTCCAACCGTCGTT -TGTTCCAATACTCAGT -TGTTCCAATCTAATTG -TGTTCCGAGTGCCGAT -TGTTCGAGGCCAAGGA -TGTTCGATCTAAGGCG -TGTTCGATGGATACGT -TGTTCGCACGGCCGGC -TGTTCGCATGTTAGCG -TGTTCGCTTCTAATCC -TGTTCGTACACGGCCA -TGTTCGTACGGTCCAG -TGTTCGTGGCGTCGTG -TGTTCTAATCGGCCAG -TGTTCTCCTGCAATTA -TGTTGATAAGGCGATC -TGTTGCCAGTCGCCTG -TGTTGCCGGAATGATC -TGTTGCCGTTCGACCA -TGTTGCGTATGTATTA -TGTTGCTATCGGTGGC -TGTTGCTCGATGTCTG -TGTTGGAAGCTACAAT -TGTTGGACGAAGGCGT -TGTTGGAGCCGCGACG -TGTTGGATAGATCAGA -TGTTGGCCAATATGGC -TGTTGGCCGGATTGGT -TGTTGGCCTGTAGCGG -TGTTGGTGAGCGGACG -TGTTGGTGATTAGGTA -TGTTGGTGCGCACGAG -TGTTGGTGCGCTTCGC -TGTTGGTGCGGAATCA -TGTTGGTGGACTCAGG diff --git a/modules/calculate_read_length.nf b/modules/calculate_read_length.nf new file mode 100644 index 0000000..0022cf3 --- /dev/null +++ b/modules/calculate_read_length.nf @@ -0,0 +1,18 @@ +/* + * Calculate the mode of R2 read lengths from the first N reads. + * Emits a warning if >10% of reads differ from the mode. + */ +process calculateReadLength { + label 'process_tiny' + + input: + path(fastq_files) + + output: + stdout + + script: + """ + calculate_read_length.py ${fastq_files} + """ +} diff --git a/modules/download_references.nf b/modules/download_references.nf new file mode 100644 index 0000000..12e6806 --- /dev/null +++ b/modules/download_references.nf @@ -0,0 +1,20 @@ +/* + * Download reference genome and gene annotation based on genome version. + * Uses storeDir to cache downloads - files are only downloaded once per genome_version. + */ +process downloadReferences { + label 'process_low' + storeDir "${params.out_dir}/references/${genome_version.replace('+', '_')}" + + input: + val(genome_version) + + output: + path("*.fa"), emit: fasta + path("*.gtf"), emit: gtf + + script: + """ + download_references.py --reference ${genome_version} + """ +} diff --git a/modules/flexiplex.nf b/modules/flexiplex.nf new file mode 100755 index 0000000..d392c64 --- /dev/null +++ b/modules/flexiplex.nf @@ -0,0 +1,35 @@ +//FIX -d option set in config file. + + +//path "${fusion_genes}_${task.index}_reads.fastq" +//path barcode_file + +process runFlexiplex { + label 'process_low' + publishDir "${params.out_dir}/flexiplex_out", mode: 'copy' + + input: + tuple val(fusion_genes), val(chrom1), val(gene1), val(base1), val(sequence1), val(chrom2), val(gene2), val(base2), val(sequence2) + path(include_list) + path(fastq_r1) + path(fastq_r2) + val(flexiplex_demultiplex_options) + + output: + path "barcodes_${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}_reads_barcodes.txt" + + script: + fusion_name="${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}" + """ + # Run flexiplex with the specified parameters + paste <(gunzip -c ${fastq_r1}) <(gunzip -c ${fastq_r2}) | \ + sed "/^[@+]/! s/^/START/g" | sed "/^[@+]/! s/ //g" | \ + flexiplex -p ${task.cpus} -n ${fusion_name} \ + -x ${sequence1}${sequence2} -d grep -f 1 > ${fusion_name}_reads.fastq + + flexiplex -x START \ + ${flexiplex_demultiplex_options} \ + -k ${include_list} -n barcodes_${fusion_name} ${fusion_name}_reads.fastq + """ +} + diff --git a/modules/formatting.nf b/modules/formatting.nf new file mode 100755 index 0000000..374bd05 --- /dev/null +++ b/modules/formatting.nf @@ -0,0 +1,53 @@ +process formatFuscia { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}", mode: 'copy' + + input: + path(fuscia_files) + val(output_file) + + output: + path("${output_file}") + + script: + def input_files = fuscia_files.collect { f -> f.name }.join(' ') + """ + format_barcodes.py --type fuscia --output '${output_file}' ${input_files} + """ +} + +process formatFlexiplex { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}", mode: 'copy' + + input: + path(barcode_files) + val(output_file) + + output: + path("${output_file}") + + script: + def input_files = barcode_files.collect { f -> f.name }.join(' ') + """ + format_barcodes.py --type flexiplex --output '${output_file}' ${input_files} + """ +} + +process formatArriba { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}", mode: 'copy' + + input: + path(barcode_files) + val(output_file) + + output: + path("${output_file}") + + script: + def input_files = barcode_files.collect { f -> f.name }.join(' ') + """ + format_barcodes.py --type arriba --output '${output_file}' ${input_files} + """ +} diff --git a/modules/fuscia.nf b/modules/fuscia.nf new file mode 100755 index 0000000..45e1394 --- /dev/null +++ b/modules/fuscia.nf @@ -0,0 +1,24 @@ +process runFuscia { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}/fuscia_out", mode: 'copy' + + input: + tuple val(fusion_genes), val(chrom1), val(gene1), val(base1), val(sequence1), val(chrom2), val(gene2), val(base2), val(sequence2) + path(bam_file) + path(bam_index) + val(mapqual) + + output: + path('*.discovered_discordant_reads.tsv') + + script: + // Use Groovy's conditional logic to handle the min and max comparison + def gr1 = "${chrom1}:${Math.min(gene1.toInteger(), base1.toInteger())}-${Math.max(gene1.toInteger(), base1.toInteger())}" + def gr2 = "${chrom2}:${Math.min(gene2.toInteger(), base2.toInteger())}-${Math.max(gene2.toInteger(), base2.toInteger())}" + def fusion_name = "${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}" + + """ + # Run the fuscia discovery command + fuscia_discover_chimeric_transcripts.py ${bam_file} ${gr1} ${gr2} . ${fusion_name} ${mapqual} + """ +} diff --git a/modules/fuscia/LICENSE b/modules/fuscia/LICENSE deleted file mode 100644 index bdbec9b..0000000 --- a/modules/fuscia/LICENSE +++ /dev/null @@ -1,21 +0,0 @@ -MIT License - -Copyright (c) 2019 Li Ding's Lab - -Permission is hereby granted, free of charge, to any person obtaining a copy -of this software and associated documentation files (the "Software"), to deal -in the Software without restriction, including without limitation the rights -to use, copy, modify, merge, publish, distribute, sublicense, and/or sell -copies of the Software, and to permit persons to whom the Software is -furnished to do so, subject to the following conditions: - -The above copyright notice and this permission notice shall be included in all -copies or substantial portions of the Software. - -THE SOFTWARE IS PROVIDED "AS IS", WITHOUT WARRANTY OF ANY KIND, EXPRESS OR -IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE WARRANTIES OF MERCHANTABILITY, -FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE AND NONINFRINGEMENT. IN NO EVENT SHALL THE -AUTHORS OR COPYRIGHT HOLDERS BE LIABLE FOR ANY CLAIM, DAMAGES OR OTHER -LIABILITY, WHETHER IN AN ACTION OF CONTRACT, TORT OR OTHERWISE, ARISING FROM, -OUT OF OR IN CONNECTION WITH THE SOFTWARE OR THE USE OR OTHER DEALINGS IN THE -SOFTWARE. diff --git a/modules/fuscia/README.md b/modules/fuscia/README.md deleted file mode 100644 index d2bdbe1..0000000 --- a/modules/fuscia/README.md +++ /dev/null @@ -1,59 +0,0 @@ -# fuscia -Detection of chimeric transcripts (aka fusions) from barcoded single cell RNA-seq - -## Usage - -The main idea of the software is to find transcripts with reads that map to different locations. If reads from a single transcript (defined as having the same cell barcode and molecular barcode) map to different locations, we say that transcript is a "chimeric transcript". Chimeric transcripts may correspond to real fusion events! - -### detect_discordant_reads.py -```{python} -python detect_discordant_reads.py star-fusion_output_file scRNA-seq.bam output_dir output_prefix region_plusminus min_mapq -``` -Uses STAR-Fusion output from bulk RNA-seq as starting point for where to look for fusion transcripts in scRNA-seq. - -#### Positional command line arguments: - -* star-fusion_output_file (STAR-Fusion output file from your bulk sample -- e.g. star-fusion.fusion_predictions.tsv) -* scRNA-seq.bam (single cell RNA-seq bam from your sample -- note: corresponding bam.bai must also exist in same directory as .bam file) -* output_dir (full or relative path to output directory) -* output_prefix (output filename prefix to distinguish results from other samples) -* region_plusminus (distance up/downstream from fusion breakpoint to look for discordant reads -- for a 2x base pair window, set region_plusminus to be x base pairs) -* min_mapq (minimum mapping quality required for reads to be analyzed) - -### discover_discordant_reads.py -```{python} -python discover_discordant_reads.py scRNA-seq.bam chrA:pos-pos chrB:pos-pos output_dir output_prefix min_mapq -``` -You define regions for discovering fusion transcripts in scRNA-seq. Not based on STAR-Fusion results. - -#### Positional command line arguments: - -* scRNA-seq.bam (single cell RNA-seq bam from your sample -- note: corresponding bam.bai must also exist in same directory as .bam file)) -* chrA:pos-pos (chromosome A base pair range where program will look for discordant reads) -* chrB:pos-pos (chromosome B base pair range where program will look for discordant reads) -* output_dir (full or relative path to output directory) -* output_prefix (output filename prefix to distinguish results from other samples) -* min_mapq (minimum mapping quality required for reads to be analyzed) - -## Output -The output file has one line for each read coming from a chimeric transcript. - -For detect_discordant_reads.py, the output file is `{output_dir}/{output_prefix}.discordant_reads.tsv`. -For discover_discordant_reads.py, the output file is `{output_dir}/{output_prefix}.discovered_discordant_reads.tsv`. - -### Output file column names - -* cell_barcode (cell the read originated from) -* molecular_barcode (molecule the read originated from) -* chrom (chromosome of read) -* start (start of read base pair mapping position) -* end (end of read base pair mapping position) -* fusion (detect_discordant_reads.py only -- corresponding bulk RNA-seq fusion called by STAR-Fusion) - -## Imports -os -pysam -sys - -## Author information -Steven Foltz ([github: envest](https://github.com/envest)) diff --git a/modules/gen_fusion_targets.nf b/modules/gen_fusion_targets.nf new file mode 100755 index 0000000..21da4c7 --- /dev/null +++ b/modules/gen_fusion_targets.nf @@ -0,0 +1,27 @@ +process genFusionTargets { + label 'process_low' + publishDir params.out_dir, mode: 'copy' + + input: + path(known_list) + path(ref_gene) + path(ref_fasta) + val(flexi_searchlen) + val(fuscia_up) + val(fuscia_down) + + output: + path "fusion_targets.csv" + + script: + """ + gen_fusion_targets.py \ + ${known_list} \ + ${ref_gene} \ + ${ref_fasta} \ + ${flexi_searchlen} \ + . \ + ${fuscia_up} \ + ${fuscia_down} + """ +} diff --git a/modules/init_tools.sh b/modules/init_tools.sh deleted file mode 100755 index 8f062bd..0000000 --- a/modules/init_tools.sh +++ /dev/null @@ -1,16 +0,0 @@ -git clone https://github.com/suhrig/arriba -cd ./arriba && make -cd .. -git clone https://github.com/alexdobin/STAR -cd ./STAR/source && make -cd ../../ -wget https://github.com/DavidsonGroup/flexiplex/releases/download/v1.02.5/flexiplex-v1.02.5.tar.gz -tar -xf flexiplex-v1.02.5.tar.gz -cd ./flexiplex && make -cd ../barcodes/ && gunzip *.gz -cd .. -wget https://github.com/samtools/samtools/releases/download/1.18/samtools-1.18.tar.bz2 -tar -xf samtools-1.18.tar.bz2 -cd samtools-1.18 -make - diff --git a/modules/prepare_include_list.nf b/modules/prepare_include_list.nf new file mode 100644 index 0000000..e878029 --- /dev/null +++ b/modules/prepare_include_list.nf @@ -0,0 +1,18 @@ +process prepareIncludeList { + label 'process_tiny' + + input: + path(include_list_file) + + output: + path("include_list.txt") + + script: + """ + if [[ "${include_list_file}" == *.gz ]]; then + gunzip -c ${include_list_file} > include_list.txt + else + cp ${include_list_file} include_list.txt + fi + """ +} diff --git a/modules/star_solo.nf b/modules/star_solo.nf new file mode 100755 index 0000000..5d154c1 --- /dev/null +++ b/modules/star_solo.nf @@ -0,0 +1,92 @@ +process buildSTARIndex { + label 'process_high' + storeDir "${params.out_dir}/references/" + + input: + path(ref_fasta) + path(ref_gtf) + val(read_length) + + output: + path("${star_index_dir}"), emit: index + + script: + sjdb_overhang = read_length.toInteger() - 1 + star_index_dir = "star_index" + """ + STAR \ + --runMode genomeGenerate \ + --runThreadN ${task.cpus} \ + --genomeDir ${star_index_dir} \ + --genomeFastaFiles ${ref_fasta} \ + --sjdbGTFfile ${ref_gtf} \ + --sjdbOverhang ${sjdb_overhang} + """ +} + +process runSTARSolo { + label 'process_high' + publishDir "${params.out_dir}/STARsolo", mode: 'copy' + + input: + path(read1) + path(read2) + path(genome_index) + path(include_list) + val(umi_len) + + output: + path("Aligned.sortedByCoord.out.bam"), emit: bam + path("Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai"), emit: bam_index + path("Solo.out/Gene/filtered/barcodes.tsv"), emit: barcodes + path("Solo.out/Gene/filtered/features.tsv"), emit: features + path("Solo.out/Gene/filtered/matrix.mtx"), emit: matrix + + script: + """ + STAR \ + --runThreadN ${task.cpus} \ + --genomeDir ${genome_index} \ + --genomeLoad NoSharedMemory \ + --readFilesIn ${read2} ${read1} \ + --readFilesCommand zcat \ + --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ + --outSAMunmapped Within \ + --outBAMcompression 0 \ + --outFilterMultimapNmax 50 \ + --peOverlapNbasesMin 10 \ + --alignSplicedMateMapLminOverLmate 0.5 \ + --alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5 \ + --chimSegmentMin 10 \ + --chimOutType WithinBAM HardClip \ + --chimJunctionOverhangMin 10 \ + --chimScoreDropMax 30 \ + --chimScoreJunctionNonGTAG 0 \ + --chimScoreSeparation 1 \ + --chimSegmentReadGapMax 3 \ + --chimMultimapNmax 50 \ + --soloType CB_UMI_Simple \ + --soloCBwhitelist $include_list \ + --soloUMIlen $umi_len \ + --soloUMIdedup NoDedup \ + --outSAMattributes NH HI nM AS CB UB \ + --soloBarcodeReadLength 0 + + samtools index Aligned.sortedByCoord.out.bam + """ +} + +process formatBAM { + label 'process_tiny' + publishDir "${params.out_dir}/STARsolo" + + output: + file('*.bam') + + script: + """ + samtools view -H Aligned.sortedByCoord.out.bam | sed -E -e 's/SN:([0-9XY])/SN:chr\1/' -e 's/SN:MT/SN:chrM/' | samtools reheader - Aligned.sortedByCoord.out.bam > Aligned.sortedByCoord.out_chr.bam + + samtools index Aligned.sortedByCoord.out_chr.bam + """ +} diff --git a/nextflow.config b/nextflow.config index a14e044..99c2936 100644 --- a/nextflow.config +++ b/nextflow.config @@ -1,67 +1,159 @@ -/* This is the configuration file, here you can adjust parameters and executors. */ - -/* pears requires: - * - reads: zipped (.fastq.gz) and formatted according to cellranger naming convention - * ([Sample Name]_S1_L00[Lane Number]_[Read Type]_001.fastq.gz) - * You will need to specify the length of the cell barcode and unique molecular identifier - * - reference genome: unzipped - * - list of known fusion (shr_ouput): output from JAFFA can be directly piped pears or in the - * format of the example.csv file - * or you can direct pears to each individual input file: - * - reads = "/path/to/reads/" - * - reference = "/path/to/reference/" - * - if you have pre-generated .fasta or gene.gtf files, ref_fasta and ref_gene - * can be changed. - * you will also need to indicate an output directory: - * - out_dir = "/path/to/output_directory/" -*/ - +/* + * ------------------------------------------------- + * PEARS Pipeline Configuration + * ------------------------------------------------- + * Single-cell fusion detection pipeline + * + * Required inputs: + * - FASTQ files (R1 and R2) + * - Genome version (e.g., GRCh38+GENCODE44) + * - Known fusions list (CSV, e.g., from JAFFA output) + * + * Usage: + * nextflow run main.nf -profile + * + * Override parameters via command line: + * nextflow run main.nf --fastq_r1 '/path/to/*_R1.fastq.gz' --out_dir './results' + */ params { - reads = "${projectDir}" - read1 = "${reads}/demo/*_1.fastq" - read2 = "${reads}/demo/*_2.fastq" - known_list = "${reads}/demo/short_input.csv" - reference = "${projectDir}/ref/" - ref_fasta = "${reference}/hg38.fa" - ref_gene = "${reference}/gencode.v44.basic.annotation.gtf" - out_dir = "/vast/projects/lab_davidson/davidson.n/20240110_Pears/pears/out" - R2_length = 91 - cellbarcode_len = 16 - umi_len = 12 - - aligned_file = "" - fuscia_mapqual = 30 - fuscia_up = 1000 - fuscia_down = 1000 - flexi_searchlen = 20 - - barcode_whitelist = "$projectDir/modules/barcodes/" - genome_version = "GRCh38+GENCODE44" - - align = true - masterdata = true + // ----- Input files ----- + fastq_r1 = null + fastq_r2 = null + known_fusions_list = null + + // ----- 10x Protocol ----- + // Select your 10x Chromium chemistry. This sets the correct barcode whitelist and UMI length. + // Available presets: + // 3' Gene Expression: 10x-3prime-v2, 10x-3prime-v3, 10x-3prime-v4 + // 5' Gene Expression: 10x-5prime-v2, 10x-5prime-v3 + protocol = null + + // ----- Read structure (auto-set by protocol, or override manually) ----- + umi_len = null // 10bp for v2 chemistries, 12bp for v3+ + barcode_include_list = null // Path to custom barcode whitelist (overrides protocol) + + // ----- Reference genome ----- + genome_version = "GRCh38+GENCODE44" // See --help for available options + star_genome_index = null // Optional: provide pre-built index to skip download/build + ref_fasta = null // Optional: provide pre-built FASTA reference + ref_gtf = null // Optional: provide pre-built GTF annotation + + // ----- Output ----- + out_dir = "pears_output" + // ----- Flexiplex parameters ----- + // Barcode demultiplexing (see Davidson et al. 2023) + flexiplex_searchlen = 20 // Search length for fusion sequence (2x actual length) + flexiplex_demultiplex_options = null // Auto-generates: -b "????????????????" -u "" -e 1 -f 0 + + // ----- FUSCIA parameters ----- + // Fusion read extraction and annotation + fuscia_mapqual = 30 // Minimum mapping quality + fuscia_up = 1000 // Upstream search distance (bp) when no gene annotation + fuscia_down = 1000 // Downstream search distance (bp) when no gene annotation } -//align = true - runs cellranger -//masterdata = true - file does not exists +/* + * ------------------------------------------------- + * Parameter Validation + * ------------------------------------------------- + */ -//adjustable parameters -/* fuscia_mapqual: minimum mapping quality of reads fuscia will look through - * fuscia_up/fuscia_down: if there is no gene annotation, you can specify a range (bp) upstream/downstream - * of the fusion breakpoint - * flexiplex_searchlen: 2x the length of sequence (bp) flexiplex will use to look for the fusion sequence. - * Please note, the longer the sequence, the longer flexiplex will take to run. - * See **Davidson et al. (2023) -*/ +plugins { + id 'nf-schema@2.3.0' +} -/* Executors **TODO: currently only available on slurm** */ +validation { + help { + enabled = true + showHidden = false + } + parametersSchema = 'nextflow_schema.json' + monochromeLogs = false + failUnrecognisedParams = true + lenientMode = false +} + +/* + * ------------------------------------------------- + * Conda Environment + * ------------------------------------------------- + */ +conda { + enabled = true + createOptions = '--yes' +} +process.conda = "${projectDir}/env/pears_env.yml" + + +/* + * ------------------------------------------------- + * Process Resource Allocation + * ------------------------------------------------- + * Assign resources using process labels: + * label 'process_high' - STAR alignment, intensive tasks + * label 'process_medium' - Moderate memory/CPU tasks + * label 'process_low' - Light processing + * label 'process_tiny' - File operations, parsing + */ process { - executor = 'slurm' - memory = '8 GB' - cpus = 4 - container = 'user/image' + withLabel: 'process_high' { + cpus = 32 + memory = { 128.GB * Math.pow(2, task.attempt - 1) } + maxRetries = 2 + errorStrategy = { task.exitStatus in [137, 140] ? 'retry' : 'finish' } + time = '48h' + } + withLabel: 'process_medium' { + cpus = 16 + memory = '64 GB' + time = '24h' + } + withLabel: 'process_low' { + cpus = 4 + memory = '16 GB' + time = '8h' + } + withLabel: 'process_tiny' { + cpus = 1 + memory = '4 GB' + time = '1h' + } +} + + +/* + * ------------------------------------------------- + * Execution Profiles + * ------------------------------------------------- + * Select with: -profile + * local - Run on local machine + * slurm - Submit to SLURM cluster + */ +profiles { + local { + process.executor = 'local' + } + slurm { + process.executor = 'slurm' + } +} + +/* + * ------------------------------------------------- + * Trace and Reporting + * ------------------------------------------------- + */ +trace { + enabled = true + file = "${params.out_dir}/nextflow_trace.txt" + overwrite = true +} + +report { + enabled = true + file = "${params.out_dir}/nextflow_report.html" + overwrite = true } -//conda env -conda.enabled = true +manifest.defaultBranch = "main" diff --git a/nextflow_schema.json b/nextflow_schema.json new file mode 100644 index 0000000..9b77599 --- /dev/null +++ b/nextflow_schema.json @@ -0,0 +1,193 @@ +{ + "$schema": "https://json-schema.org/draft/2020-12/schema", + "$id": "https://raw.githubusercontent.com/pears-pipeline/pears/main/nextflow_schema.json", + "title": "PEARS Pipeline Parameters", + "description": "Single-cell fusion detection pipeline", + "type": "object", + "defs": { + "input_options": { + "title": "Input Options", + "type": "object", + "description": "Input FASTQ files and fusion list", + "properties": { + "fastq_r1": { + "type": "string", + "format": "path", + "pattern": "^\\S+\\.f(ast)?q(\\.gz)?$|^\\S+\\*\\S*$", + "description": "Path to Read 1 FASTQ file(s). Glob patterns allowed.", + "fa_icon": "fas fa-dna" + }, + "fastq_r2": { + "type": "string", + "format": "path", + "pattern": "^\\S+\\.f(ast)?q(\\.gz)?$|^\\S+\\*\\S*$", + "description": "Path to Read 2 FASTQ file(s). Glob patterns allowed.", + "fa_icon": "fas fa-dna" + }, + "known_fusions_list": { + "type": "string", + "format": "file-path", + "mimetype": "text/csv", + "description": "CSV file containing known fusions (e.g., JAFFA output).", + "fa_icon": "fas fa-file-csv" + } + }, + "required": ["fastq_r1", "fastq_r2", "known_fusions_list"] + }, + "reference_options": { + "title": "Reference Options", + "type": "object", + "description": "Reference genome configuration", + "properties": { + "genome_version": { + "type": "string", + "default": "GRCh38+GENCODE44", + "description": "Genome assembly and annotation version. References will be downloaded automatically if ref_fasta, ref_gtf, and star_genome_index are not provided.", + "fa_icon": "fas fa-dna", + "enum": [ + "GRCh38+GENCODE40", + "GRCh38+GENCODE41", + "GRCh38+GENCODE42", + "GRCh38+GENCODE43", + "GRCh38+GENCODE44", + "GRCh38+GENCODE45", + "GRCh38+GENCODE46", + "GRCh38+GENCODE47", + "GRCh38+GENCODE48", + "GRCh38+GENCODE49" + ] + }, + "star_genome_index": { + "type": "string", + "format": "directory-path", + "description": "Path to pre-built STAR genome index. If provided, ref_fasta and ref_gtf must also be provided.", + "fa_icon": "fas fa-folder" + }, + "ref_fasta": { + "type": "string", + "format": "file-path", + "description": "Path to reference genome FASTA file. If provided, ref_gtf and star_genome_index must also be provided.", + "fa_icon": "fas fa-file" + }, + "ref_gtf": { + "type": "string", + "format": "file-path", + "description": "Path to reference GTF annotation file. If provided, ref_fasta and star_genome_index must also be provided.", + "fa_icon": "fas fa-file-alt" + } + }, + "dependentRequired": { + "star_genome_index": ["ref_fasta", "ref_gtf"], + "ref_fasta": ["ref_gtf", "star_genome_index"], + "ref_gtf": ["ref_fasta", "star_genome_index"] + } + }, + "output_options": { + "title": "Output Options", + "type": "object", + "description": "Output directory configuration", + "properties": { + "out_dir": { + "type": "string", + "format": "directory-path", + "default": "pears_output", + "description": "Directory for pipeline output files.", + "fa_icon": "fas fa-folder-open" + } + } + }, + "protocol_options": { + "title": "Protocol Preset Options", + "type": "object", + "description": "Choose a protocol preset OR provide both umi_len and barcode_include_list manually.", + "properties": { + "protocol": { + "type": "string", + "description": "10x Chromium chemistry preset. Sets the correct barcode whitelist and UMI length automatically.", + "fa_icon": "fas fa-flask", + "enum": [ + "10x-3prime-v2", + "10x-3prime-v3", + "10x-3prime-v4", + "10x-5prime-v2", + "10x-5prime-v3" + ], + "enumNames": [ + "10x 3' Gene Expression v2 (UMI: 10bp, Barcodes: 737K-august-2016.txt.gz)", + "10x 3' Gene Expression v3/v3.1 (UMI: 12bp, Barcodes: 3M-february-2018.txt.gz)", + "10x 3' Gene Expression v4 (UMI: 12bp, Barcodes: 3M-3pgex-may-2023.txt.gz)", + "10x 5' Gene Expression v1/v2 (UMI: 10bp, Barcodes: 737K-august-2016.txt.gz)", + "10x 5' Gene Expression v3 (UMI: 12bp, Barcodes: 3M-5pgex-jan-2023.txt.gz)" + ] + }, + "umi_len": { + "type": "integer", + "minimum": 1, + "description": "Length of UMI in nucleotides. Auto-set by protocol (10bp for v2, 12bp for v3+). Only required if protocol is not specified.", + "fa_icon": "fas fa-barcode" + }, + "barcode_include_list": { + "type": "string", + "format": "file-path", + "description": "Path to custom cell barcode whitelist file (can be gzipped). Overrides the protocol default if specified.", + "fa_icon": "fas fa-list" + } + } + }, + "fuscia_options": { + "title": "FUSCIA Options", + "type": "object", + "description": "Parameters for fusion read extraction", + "properties": { + "fuscia_mapqual": { + "type": "integer", + "default": 30, + "minimum": 0, + "description": "Minimum mapping quality for reads.", + "fa_icon": "fas fa-filter" + }, + "fuscia_up": { + "type": "integer", + "default": 1000, + "minimum": 0, + "description": "Upstream search distance (bp) when no gene annotation available.", + "fa_icon": "fas fa-arrow-left" + }, + "fuscia_down": { + "type": "integer", + "default": 1000, + "minimum": 0, + "description": "Downstream search distance (bp) when no gene annotation available.", + "fa_icon": "fas fa-arrow-right" + } + } + }, + "flexiplex_options": { + "title": "Flexiplex Options", + "type": "object", + "description": "Parameters for barcode demultiplexing", + "properties": { + "flexiplex_searchlen": { + "type": "integer", + "default": 20, + "minimum": 0, + "description": "Search length for fusion sequence (2x actual length). Longer values increase runtime.", + "fa_icon": "fas fa-search" + }, + "flexiplex_demultiplex_options": { + "type": "string", + "description": "Override flexiplex demultiplex options. If set to null, options are auto-generated: -b \"?{barcode_length}\" (barcode length is dynamically determined from the barcode include-list file), -u \"\" (UMI length based on protocol or umi_len), -e 1 -f 0.", + "fa_icon": "fas fa-cog" + } + } + } + }, + "allOf": [ + { "$ref": "#/defs/input_options" }, + { "$ref": "#/defs/protocol_options" }, + { "$ref": "#/defs/reference_options" }, + { "$ref": "#/defs/output_options" }, + { "$ref": "#/defs/flexiplex_options" }, + { "$ref": "#/defs/fuscia_options" } + ] +} diff --git a/subworkflows/arriba.nf b/subworkflows/arriba.nf deleted file mode 100755 index 0d0a2f4..0000000 --- a/subworkflows/arriba.nf +++ /dev/null @@ -1,64 +0,0 @@ -process runArriba { - publishDir "${params.out_dir}/arriba_out", mode: 'copy' - time = '1d' - memory = '150' - - input: - path bam_file - - output: - path "fusions.tsv" - - script: - """ - - ${projectDir}/modules/arriba/arriba \ - -x $bam_file \ - -o fusions.tsv \ - -O fusions.discarded.tsv \ - -a $params.ref_fasta \ - -g $params.ref_gene \ - -f blacklist - """ -} - - -//path "${fusion_genes}_${task.index}.fastq" -//path barcodes_file - -process getBarcodes_Arriba { - echo = true - publishDir "${params.out_dir}/arriba_out", mode: 'copy' - - input: - tuple val (fusion_genes), val (chrom1), val (gene1), val (base1), val (sequence1), val (chrom2), val (gene2), val (base2), val (sequence2) - path fusion_table - params.possible_barcode_list - - output: - path "barcodes_${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}_reads_barcodes.txt" - - shell: - """ - set +e - - fus=`echo !{fusion_genes} | sed 's/--/\t/g'` ; - pos=`echo -e "!{chrom1}:!{base1}\t!{chrom2}:!{base2}"` - fusion_name=`echo !{fusion_genes}_!{chrom1}_!{base1}_!{chrom2}_!{base2}` - - grep -e "\$fus" -e "\$pos" !{fusion_table} |\ - cut -f30 |\ - sed 's/,/ \\n/g' |\ - sed 's/^/^@/g' |\ - grep -f - <(gunzip -c !{params.read1}) -A3 --no-group-separator |\ - sed "/^[@+]/! s/^/START/g" > "\$fusion_name".fastq ; - - ${projectDir}/modules/flexiplex/flexiplex -x START \ - ${params.flexiplex_demultiplex_options} \ - -k ${params.possible_barcode_list} -n barcodes_"\$fusion_name" \ - "\$fusion_name".fastq - - """ - -} - diff --git a/subworkflows/flexiplex.nf b/subworkflows/flexiplex.nf deleted file mode 100755 index b387f34..0000000 --- a/subworkflows/flexiplex.nf +++ /dev/null @@ -1,35 +0,0 @@ -//FIX -d option set in config file. - - -//path "${fusion_genes}_${task.index}_reads.fastq" -//path barcode_file - -process runFlexiplex { - publishDir "${params.out_dir}/flexiplex_out", mode: 'copy' - - input: - tuple val (fusion_genes), val (chrom1), val (gene1), val (base1), val (sequence1), val (chrom2), val (gene2), val (base2), val (sequence2) - params.possible_barcode_list - - - output: - path "barcodes_${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}_reads_barcodes.txt" - - script: - """ - # Define the fusion name and flexiplex path - fusion_name="${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}" - - # Run flexiplex with the specified parameters - paste <(gunzip -c ${params.read1}) <(gunzip -c ${params.read2}) | \ - sed "/^[@+]/! s/^/START/g" | sed "/^[@+]/! s/ //g" | \ - ${projectDir}/modules/flexiplex/flexiplex -p $task.cpus -n \${fusion_name} \ - -x ${sequence1}${sequence2} -d grep -f 1 > \${fusion_name}_reads.fastq - - ${projectDir}/modules/flexiplex/flexiplex -x START \ - ${params.flexiplex_demultiplex_options} \ - -k ${params.possible_barcode_list} -n barcodes_\${fusion_name} \${fusion_name}_reads.fastq - - """ -} - diff --git a/subworkflows/formatting.nf b/subworkflows/formatting.nf deleted file mode 100755 index cc65072..0000000 --- a/subworkflows/formatting.nf +++ /dev/null @@ -1,82 +0,0 @@ -process formatFuscia{ - publishDir "${params.out_dir}", mode: 'copy' - - input: - val "fuscia complete" - val output_file - - output: - path "${output_file}" - - script: - """ - #!/usr/bin/env python3 - - import pandas as pd - import os - - def add_fusion_name(file): - r = pd.read_table(file) - if r.empty == False: - r['fusion'] = os.path.basename(file).split("_")[0] - r = r[r['cell_barcode'] != '-'] - return r - - in_dir = '$params.out_dir/fuscia_out/' - df = pd.DataFrame(columns=['cell_barcode', 'molecular_barcode','fusion']) - for file in os.listdir(in_dir): - r = add_fusion_name(f'{in_dir}{file}') - if r is not None: - df = pd.concat([df, r], axis = 0, ignore_index = True) - df['cell_barcode'] = df['cell_barcode'].str.replace('-1', "") - - # Remove the last two columns - df = df.iloc[:, :-3] - # Remove non-unique rows - df = df.drop_duplicates() - - df.to_csv('${output_file}', index=False) - - """ -} - -process formatFlexiplex{ - publishDir "${params.out_dir}", mode: 'copy' - - input: - path('*') - val dir - val output_file - - output: - path "${output_file}" - - script: - """ - #!/usr/bin/env python3 - - import pandas as pd - import os - - def add_fusion_name(file): - r = pd.read_table(file) - if r.empty == False: - df_temp = pd.DataFrame().assign(cell_barcode = r['CellBarcode'], molecular_barcode = r['UMI']) - df_temp['fusion'] = os.path.basename(file).split("_")[1] - return df_temp - - in_dir = f'$params.out_dir/$dir/' - df = pd.DataFrame(columns = ['cell_barcode', 'molecular_barcode', 'fusion']) - for file in os.listdir(in_dir): - if os.path.basename(file)[0:8] == 'barcodes': - r = add_fusion_name(f'{in_dir}/{file}') - df = pd.concat([df, r], axis = 0, ignore_index = True) - # Remove non-unique rows - df = df.drop_duplicates() - df.to_csv(f'$output_file', index=False) - - """ - -} - - diff --git a/subworkflows/fuscia.nf b/subworkflows/fuscia.nf deleted file mode 100755 index c919690..0000000 --- a/subworkflows/fuscia.nf +++ /dev/null @@ -1,42 +0,0 @@ -process runFuscia { - publishDir "${params.out_dir}/fuscia_out", mode: 'copy' - - input: - tuple val (fusion_genes), val (chrom1), val (gene1), val (base1), val (sequence1), val (chrom2), val (gene2), val (base2), val (sequence2) - path bam_file - path bam_index - - output: - path('*') - - script: - // Use Groovy's conditional logic to handle the min and max comparison - def gr1 = "${chrom1}:${Math.min(gene1.toInteger(), base1.toInteger())}-${Math.max(gene1.toInteger(), base1.toInteger())}" - def gr2 = "${chrom2}:${Math.min(gene2.toInteger(), base2.toInteger())}-${Math.max(gene2.toInteger(), base2.toInteger())}" - def fusion_name = "${fusion_genes}_${chrom1}_${base1}_${chrom2}_${base2}" - - """ - # Define regions and fusion name in shell format - gr1=$gr1 - gr2=$gr2 - fusion_name=$fusion_name - - # Run the fuscia discovery command - python $projectDir/modules/fuscia/discover_chimeric_transcripts.py $bam_file $gr1 $gr2 . $fusion_name $params.fuscia_mapqual - """ -} -/** - - """ - #!/usr/bin/env python3 - import os - os.makedirs('$params.out_dir/fuscia_out', exist_ok = True) - gr1 = f'$chrom1:{min($gene1, $base1)}-{max($gene1, $base1)}' - gr2 = f'$chrom2:{min($gene2, $base2)}-{max($gene2, $base2)}' - fusion_name = f'${fusion_genes}_${task.index}' - command = f'python $projectDir/modules/fuscia/discover_chimeric_transcripts.py {bam_file[0]} {gr1} {gr2} . {fusion_name} $params.fuscia_mapqual' - os.system(command) - """ - - -**/ \ No newline at end of file diff --git a/subworkflows/gen_STAR_genome.nf b/subworkflows/gen_STAR_genome.nf deleted file mode 100644 index 0022420..0000000 --- a/subworkflows/gen_STAR_genome.nf +++ /dev/null @@ -1,17 +0,0 @@ -process gen_genome{ - publishDir "${projectDir}/modules/STAR/" - - script: - """ - - $projectDir/modules/arriba/download_references.sh $params.genome_version - - $projectDir/modules/STAR/source/STAR --runThreadN $params.cpus \ - --runMode genomeGenerate \ - --genomeDir $projectDir/STAR/STAR_index_GRCh38_GENCODE38 \ - --genomeFastaFiles $projectDir/arriba/GRCh38.fa\ - --sjdbGTFfile $projectDir/arriba/GENCODE38.gtf\ - --sjdbOverhang $params.R2_length - 1 - """ - -} diff --git a/subworkflows/gen_masterdata.nf b/subworkflows/gen_masterdata.nf deleted file mode 100755 index 3bc365f..0000000 --- a/subworkflows/gen_masterdata.nf +++ /dev/null @@ -1,29 +0,0 @@ -// conda "${projectDir}/env/pears_env.yml" - - -process GEN_MASTERDATA { - publishDir params.out_dir, mode: 'copy' - - input: - params.known_list - params.reference - params.flexiplex_searchlen - params.out_dir - params.fuscia_up - params.fuscia_down - - output: - path "masterdata.csv" - - script: - """ - - python $projectDir/subworkflows/gen_masterdata.py \ - $params.known_list \ - $params.ref_gene \ - $params.ref_fasta \ - $params.flexiplex_searchlen . $params.fuscia_up $params.fuscia_down - - """ - -} diff --git a/subworkflows/run_STARsolo.nf b/subworkflows/run_STARsolo.nf deleted file mode 100755 index afb668c..0000000 --- a/subworkflows/run_STARsolo.nf +++ /dev/null @@ -1,73 +0,0 @@ -process RUN_STARsolo { - publishDir "${params.out_dir}/STARsolo", mode: 'copy' - time = '1d' - memory = '200' - - input: - params.genome_index - params.read1 - params.read2 - params.out_dir - params.STAR - params.possible_barcode_list - - output: - path "Aligned.sortedByCoord.out.bam" // Define outputs - path "Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai" - path "Solo.out/Gene/filtered/barcodes.tsv" - path "Solo.out/Gene/filtered/features.tsv" - path "Solo.out/Gene/filtered/matrix.mtx" - - script: - """ - $params.STAR \ - --runThreadN $task.cpus \ - --genomeDir $params.genome_index \ - --genomeLoad NoSharedMemory \ - --readFilesIn $params.read2 $params.read1 \ - --readFilesCommand zcat \ - --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \ - --outSAMunmapped Within \ - --outBAMcompression 0 \ - --outFilterMultimapNmax 50 \ - --peOverlapNbasesMin 10 \ - --alignSplicedMateMapLminOverLmate 0.5 \ - --alignSJstitchMismatchNmax 5 -1 5 5 \ - --chimSegmentMin 10 \ - --chimOutType WithinBAM HardClip \ - --chimJunctionOverhangMin 10 \ - --chimScoreDropMax 30 \ - --chimScoreJunctionNonGTAG 0 \ - --chimScoreSeparation 1 \ - --chimSegmentReadGapMax 3 \ - --chimMultimapNmax 50 \ - --soloType CB_UMI_Simple \ - --soloCBwhitelist $params.possible_barcode_list \ - --soloUMIlen $params.umi_len \ - --soloUMIdedup NoDedup \ - --outSAMattributes NH HI nM AS CB UB \ - --soloBarcodeReadLength 0 - - $projectDir/modules/samtools-1.18/samtools index Aligned.sortedByCoord.out.bam - - """ - -} - -process format_bam { - publishDir "${params.out_dir}/STARsolo" - - input: - RUN_STARsolo.out - - output: - file('*.bam') into bam_files, val("aligner done") into aligner_done - - script: - """ - $projectDir/modules/samtools-1.18/samtools view -H Aligned.sortedByCoord.out.bam | sed -E -e 's/SN:([0-9XY])/SN:chr\1/' -e 's/SN:MT/SN:chrM/' | samtools reheader - Aligned.sortedByCoord.out.bam > Aligned.sortedByCoord.out_chr.bam - - $projectDir/modules/samtools-1.18/samtools index file Aligned.sortedByCoord.out_chr.bam - """ - -}